骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)異源二聚體在誘導(dǎo)成骨發(fā)生及破骨發(fā)生的體外研究.pdf

1、骨缺損在臨床上十分普遍，而由多種原因造成的極限骨缺損仍是正頜外科、口腔頜面外科以及口腔種植科醫(yī)生所面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)之一。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)是一組具有誘導(dǎo)異位成骨能力的二聚體蛋白，屬于轉(zhuǎn)移生長因子-β超家族成員，是促進(jìn)骨再生研究領(lǐng)域的主要細(xì)胞因子之一。在極限骨缺損修復(fù)中，BMPs的介入治療由于其具有相對(duì)便利的可操作性有望替代骨移植治療。
　　 第一部分：骨形態(tài)發(fā)生蛋白異源二聚體誘導(dǎo)成骨發(fā)生的體外比較研究
　　 目的：

2、BMP同源二聚體（如BMP2、 BMP7）由于其過高的有效使用劑量而未能在臨床普遍應(yīng)用。BMP異源二聚體近年來被報(bào)道具有比相應(yīng)同源二聚體更強(qiáng)的誘導(dǎo)骨形成作用。然而，BMP異源二聚體在一系列成骨發(fā)生細(xì)胞事件，如細(xì)胞趨化遷移、細(xì)胞增殖、成骨分化以及細(xì)胞基質(zhì)外礦化等環(huán)節(jié)中的具體生物學(xué)作用尚不明確。本實(shí)驗(yàn)旨在采用純化的rhBMP2/7異源二聚體以及相應(yīng)的同源二聚體分別作用于成骨前體細(xì)胞，以此比較研究BMP異源二聚體在體外誘導(dǎo)成骨發(fā)生的具體生物學(xué)

3、功能特點(diǎn)。
　　 材料和方法：通過時(shí)間梯度和濃度梯度系統(tǒng)性研究rhBMP2/7、 rhBMP2、 rhBMP7以及rhBMP2和rhBMP7的等比混合在誘導(dǎo)成骨前體細(xì)胞MC3T3-E1成骨發(fā)生過程中的作用，檢測(cè)成骨發(fā)生各階段的相關(guān)指標(biāo)：用實(shí)時(shí)定量細(xì)胞電感應(yīng)/細(xì)胞遷移系統(tǒng)(RT-CES/CIM system)監(jiān)測(cè)細(xì)胞趨化遷移運(yùn)動(dòng)；用熒光定量法檢測(cè)細(xì)胞增殖后DNA含量；用比色法檢測(cè)細(xì)胞成骨分化堿性磷酸酶(ALP)活性；用ELISA方

4、法檢測(cè)成骨細(xì)胞骨鈣素(OCN)的分泌量；用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞成骨相關(guān)基因(ALP、 OCN、 Coll、 Runx2)的表達(dá)水平；用茜素紅染色觀察并計(jì)量細(xì)胞礦化培養(yǎng)后的基質(zhì)外礦化結(jié)節(jié)面積。
　　 結(jié)果：RhBMP2/7異源二聚體在誘導(dǎo)成骨發(fā)生的各階段均呈現(xiàn)與rhBMP同源二聚體相似的作用模式。RhBMP2/7誘導(dǎo)MC3T3-E1趨化遷移、細(xì)胞增殖和細(xì)胞成骨分化的起效濃度和最佳濃度是rhBMP同源二聚體的1/10～1

5、/2，但其最大作用效果除了誘導(dǎo)細(xì)胞趨化遷移顯著高于同源二聚體外，其余幾項(xiàng)指標(biāo)，包括ALP活性、OCN表達(dá)量均與rhBMP2的最大作用效果相近。此外，在較低濃度范圍內(nèi)(5-100ng/ml)， rhBMP2/7異源二聚體在細(xì)胞成骨發(fā)生的早期階段（第1～4天）相比與rhBMP同源二聚體的作用優(yōu)勢(shì)要顯著強(qiáng)于細(xì)胞成骨發(fā)生的后階段（第4～7天）。與以往的研究結(jié)果相似，rhBMP同源二聚體的等比混合并不能帶來協(xié)同效果。茜素紅鈣化結(jié)節(jié)染色面積的比較突

6、出表明了rhBMP2/7(50ng/ml)在3周時(shí)即能有效促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)礦化；而rhBMP同源二聚體組(50ng/ml)以及對(duì)照組均只有在4周時(shí)才能觀察到礦化結(jié)節(jié)，并且，rhBMP2/7誘導(dǎo)的礦化面積是rhBMP2組的12倍，rhBMP7組的38倍。不管是rhBMP2/7還是rhBMP同源二聚體，在誘導(dǎo)細(xì)胞趨化遷移、增殖、ALP活性以及成骨相關(guān)基因表達(dá)上都呈現(xiàn)濃度-效應(yīng)鐘形曲線，即并非濃度越高，作用效果越好，提示了rhBMPs必須以適宜

7、的濃度作用于細(xì)胞才能發(fā)揮其誘導(dǎo)細(xì)胞成骨發(fā)生各環(huán)節(jié)的最佳作用效果。
　　 結(jié)論：RhBMP2/7異源二聚體在誘導(dǎo)細(xì)胞成骨發(fā)生的有效作用濃度低至5ng/ml，是相應(yīng)同源二聚體的1/10，并于50ng/ml達(dá)到作用峰值平臺(tái)期，其水平與相應(yīng)同源二聚體在高濃度時(shí)獲得的最高作用水平無顯著性差異。該特點(diǎn)使得rhBMP2/7有替代rhBMP2應(yīng)用于臨床的潛力，并且符合生理規(guī)律的低水平緩慢釋放能使rhBMP2/7在誘導(dǎo)成骨發(fā)生過程中發(fā)揮最佳效果。

8、
　　 第二部分：骨形態(tài)發(fā)生蛋白異源二聚體影響破骨發(fā)生的體外比較研究
　　 目的：BMP同源二聚體能顯著刺激破骨細(xì)胞的分化和功能，特別是當(dāng)其以較高的臨床使用劑量應(yīng)用時(shí)。BMP異源二聚體由于其具有低濃度起效，有效作用濃度低等特點(diǎn)有望替代BMP2同源二聚體。但現(xiàn)有的文獻(xiàn)報(bào)道尚未涉及BMP異源二聚體對(duì)破骨細(xì)胞的作用。BMP異源二聚體是否在破骨發(fā)生中也呈現(xiàn)低濃度起效的作用特點(diǎn)值得研究。本實(shí)驗(yàn)的目的在于比較研究BMP異源二聚體和相

9、應(yīng)的同源二聚體在影響細(xì)胞破骨發(fā)生中的作用。
　　 材料與方法：通過時(shí)間梯度和濃度梯度系統(tǒng)性研究rhBMP2/7、 rhBMP2、 rhBMP7以及rhBMP2和rhBMP7的等比混合在影響RANKL(50ng/ml)誘導(dǎo)的破骨前體細(xì)胞RAW264.7破骨發(fā)生過程中的作用，檢測(cè)破骨發(fā)生各階段的相關(guān)指標(biāo)：用熒光定量法檢測(cè)細(xì)胞增殖后DNA含量；用比色法檢測(cè)細(xì)胞破骨分化抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)活性；用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)細(xì)

10、胞成骨相關(guān)基因（TRAP基因Acp5、降鈣素受體基因Caclcr、蛋白組織酶K基因Ctsk）的表達(dá)水平；用TRAP染色觀察并計(jì)量TRAP+多核細(xì)胞(TRAP+MNCs)的表面積、數(shù)目以及單位表面積；用破骨細(xì)胞活性分析板(OAAS)檢測(cè)破骨細(xì)胞的鈣鹽吸收功能。
　　 結(jié)果：經(jīng)過3d的rhBMPs刺激，RANKL誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞增殖明顯，并出現(xiàn)融合。RhBMP2/7的最有效促進(jìn)增殖濃度是150ng/ml， rhBMP2、

11、rhBMP7均是10ng/ml， rhBMP2+rhBMP7是100ng/ml，四組之間的最高DNA含量水平基本相近。經(jīng)過4d的rhBMPs刺激，TRAP活性均被有所上調(diào)，并以100-150ng/ml時(shí)上調(diào)幅度最大。破骨相關(guān)基因的表達(dá)變化顯示rhBMP2在200ng/ml時(shí)能有效促進(jìn)Acp5基因的表達(dá)，而rhBMP2/7、 rhBMP7無顯著上調(diào)作用。Calcr的表達(dá)水平與RANKL對(duì)照組相比反而降低，特別是rhBMP2/7和rhBMP

12、2在5ng/ml時(shí)以及rhBMP7在200ng/ml時(shí)。RhBMPs的額外加入對(duì)Ctsk表達(dá)水平的影響與RANKL對(duì)照組相比略有升降，但并無顯著性差異。TRAP+MNCs最大表面積在150ng/ml的rhBMP2作用下獲得，并顯著高于150ng/ml的rhBMP2/7以及100ng/ml的rhBMP7。各組誘導(dǎo)的TRAP+MNCs數(shù)目的最高值基本相近，相應(yīng)的TRAP+MNCs單位表面積以rhBMP2(200ng/ml)組最大。經(jīng)過7d的

13、rhBMPs刺激，所有實(shí)驗(yàn)組的破骨細(xì)胞在OAAS板上形成的鈣鹽吸收陷窩面積平均值均顯著大于RANKL對(duì)照組，除了rhBMP7(150ng/ml)。比較這三組rhBMP的促進(jìn)破骨細(xì)胞鈣鹽吸收的作用，獲得最大吸收面積的組別依次為rhBMP2(150ng/ml)，rhBMP2(50ng/ml)和rhBMP2/7(150ng/ml)，以及rhBMP7(5ng/ml)。RhBMP2和rhBMP7的等比混合在各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)中并沒有產(chǎn)生協(xié)同作用。

14、r>　　 結(jié)論：RhBMP2/7、rhBMP2以及rhBMP7都能進(jìn)一步調(diào)控經(jīng)RANKL誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞的破骨發(fā)生。RhBMP2/7異源二聚體在其中呈現(xiàn)濃度依賴效應(yīng)遞增趨勢(shì)，并且僅在高濃度時(shí)誘導(dǎo)破骨發(fā)生的最大作用效果稍低或接近于rhBMP2同源二聚體。以上結(jié)果提示，當(dāng)rhBMP2/7低劑量應(yīng)用時(shí)，僅能最小程度地刺激細(xì)胞破骨發(fā)生，因此在促進(jìn)成骨發(fā)生的同時(shí)并不會(huì)帶來顯著的破骨吸收。
　　 總結(jié)
　　 RhBMP2

15、/7異源二聚體在誘導(dǎo)細(xì)胞成骨發(fā)生的有效作用濃度低至5ng/ml，并于50ng/ml達(dá)到作用峰值平臺(tái)期；而相應(yīng)rhBMP2、rhBMP7同源二聚體的起效濃度為50ng/ml;兩者在各自適宜濃度時(shí)誘導(dǎo)成骨發(fā)生的最大作用效果相近。
　　 RhBMP2/7異源二聚體在誘導(dǎo)細(xì)胞破骨發(fā)生的過程中，在5-200ng/ml濃度范圍內(nèi)基本呈現(xiàn)濃度依賴效應(yīng)遞增趨勢(shì)，在高濃度時(shí)誘導(dǎo)破骨發(fā)生的最大作用效果稍低或接近于rhBMP2同源二聚體。