骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2誘導成骨過程中血管內皮生長因子的表達及意義.pdf

1、第一部分骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2誘導成骨過程中血管內皮生長因子的表達及分析 目的探討骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bonemorphogeneticprotein-2，BMP-2)誘導成骨過程中血管內皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)的表達情況，以加深對BMP-2誘導成骨機制的認識，為BMP-2的進一步臨床應用奠定理論基礎。 方法采用昆明鼠20只，外科手術建立股部肌袋誘導成骨模型，以左

2、側大腿為實驗組，右側為對照組。實驗組肌袋內植入以明膠和羥基磷灰石復合物為載體的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(rhBMP-2)0.25mg；對照組僅植入空白載體。分別于術后3、7、14和21天取材，采用原位雜交和免疫組化方法檢測VEGFmRNA及蛋白的表達情況。 結果術后3d可見大量間充質細胞聚集，胞漿出現VEGF的表達，但隨著間充質細胞分化為前軟骨細胞并不斷成熟，VEGF在間充質細胞內的表達逐漸消失，而在成軟骨細胞和軟骨細胞內的表達

3、水平迅速提高，VEGF在成熟軟骨細胞中的表達最為活躍，至到新骨形成，在成骨細胞和骨細胞中仍可檢測到VEGF的強烈表達;而對照組則未檢測到VEGF的表達。 結論VEGF的表達貫穿BMP-2誘導成骨的全過程，并在成熟軟骨細胞和成骨細胞呈現強烈表達；BMP-2具有促進VEGF合成與分泌的作用。盡管VEGF在這一過程中的意義尚不完全明確，但這對進一步闡明BMP-2誘導成骨的機制提供了新的思路，為BMP-2的進一步臨床應用奠定了理論基礎。

4、 第二部分鼠胚成骨細胞的原代培養(yǎng)與鑒定 目的探討一種經濟、高效的原代成骨細胞培養(yǎng)方法，為進一步的實驗研究奠定基礎。 方法孕齡19d的KM小鼠，無菌條件下剖腹取出胎鼠，然后取胎鼠的顱蓋骨，剔凈、漂洗、剪碎。用0.25％胰蛋白酶消化10min，終止消化后將碎骨塊接種于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，通過相差顯微鏡、透射電鏡觀察，堿性磷酸酶染色、骨鈣素免疫組化染色和鈣結節(jié)茜素紅染色等方法對所獲得細胞進行鑒定。 結果所培養(yǎng)的細胞具

5、有典型的成骨細胞形態(tài)特征，堿性磷酸酶染色、骨鈣素染色和鈣結節(jié)染色均呈陽性。 結論改良的組織塊培養(yǎng)法可在較短時間內獲得大量成骨細胞，所培養(yǎng)的細胞具有典型的成骨細胞形態(tài)和功能。 第三部分BMP-2促進鼠胚成骨細胞VEGF表達的劑量依賴性效應 目的通過不同劑量重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(recombinanthumanbonemorphogeneticprotein-2，rhBMP-2)刺激原代培養(yǎng)的小鼠胚胎成骨細胞，探

6、討B(tài)MP-2對成骨細胞血管內皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)表達的影響。 方法取19d胎齡的小鼠胚胎顱骨成骨細胞進行體外培養(yǎng)，采用RT-PCR和Westernblot法分別檢測不同濃度rhBMP-2對成骨細胞VEGFmRNA及蛋白表達的影響。 結果RT-PCR及Westernblot法檢測表明，VEGFmRNA及蛋白在原代成骨細胞內穩(wěn)定表達；半定量分析證實，不同rhB

7、MP-2劑量組間VEGFmRNA的表達量呈一定變化規(guī)律，隨著rhBMP-2濃度的升高，VEGFmRNA的表達量逐漸增加，當rhBMP-2劑量為300ng/ml左右時，VEGFmRNA的表達量最高，超過此劑量，VEGF的表達則有下降趨勢。 結論VEGF可在原代鼠胚成骨細胞內穩(wěn)定表達；rhBMP-2可促進VEGF在成骨細胞的表達，并呈一定的劑量依賴性關系，rhBMP-2劑量為300ng/ml左右時，其促進作用最佳。 第四部分

8、BMP-2促進鼠胚成骨細胞VEGF表達的時間依賴性效應 目的探討B(tài)MP-2促進鼠胚成骨細胞VEGF表達的時間規(guī)律。 方法取19d胎齡的小鼠胚胎顱骨成骨細胞進行體外培養(yǎng)，采用RT-PCR法分別檢測不同作用時間下rhBMP-2(300ng/ml)對成骨細胞VEGFmRNA表達的影響。 結果RT-PCR法檢測表明，應用相同劑量rhBMP-2(300ng/ml)刺激成骨細胞時，不同作用時間下VEGFmRNA的表達量不同，

9、呈雙時相，分別在3h和24h時出現峰值，48h時VEGFmRNA的表達仍保持較高水平。減除各自對照組的影響，各時間點VEGF表達的相對值([rhBMP-2組/對照組]比值)亦呈時間依賴性關系，6h時明顯升高，約為對照組的2.6倍(P＜0.05)。VEGFmRNA的第2個峰值出現在大約36h左右，約為對照組的2倍。48h時，VEGFmRNA的相對水平仍然保持較高水平。 結論rhBMP-2對VEGF表達的促進作用呈時間依賴關系，分別

10、在3h和24h時出現峰值，48h時VEGFmRNA的表達仍保持較高水平。減除各自對照組的影響，各時間點VEGF表達的相對值(rhBMP-2組/對照組)亦呈時間依賴性效應，兩個峰值分別出現在6h或36h左右。 第五部分BMP-2促進鼠胚成骨細胞VEGF表達的機制研究 目的探討重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(recombinanthumanbonemorphogeneticprotein-2，rhBMP-2)促進鼠胚成骨細胞血管內

11、皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)表達的機制。 方法取19d胎齡的小鼠胚胎顱骨成骨細胞進行體外培養(yǎng)，在加入rhBMP-2誘導成骨的同時，分別加入放線菌素D、放線菌酮和羥(基)脲等三種藥物，RT-PCR法檢測VEGFmRNA表達的變化。 結果應用放線菌素D阻斷基因轉錄后，可降低對照組成骨細胞VEGFmRNA的表達，并可完全抑制BMP-2對VEGF表達的促進作用。用放線菌酮

12、阻斷成骨細胞的蛋白合成后，可增加對照組成骨細胞VEGFmRNA的表達，但并不能完全抑制BMP-2對VEGFmRNA表達的促進作用。應用羥(基)脲阻斷DNA合成后，可抑制BMP-2對VEGF分泌的促進作用。 結論rhBMP-2對鼠胚成骨細胞VEGF基因表達的促進作用，主要通過促進VEGFmRNA的轉錄，并與BMP-2的促有絲分裂活性密切相關，新蛋白的合成并不是促進VEGFmRNA表達的必要條件。 第六部分血管內皮生長因子在

13、BMP-2誘導成骨細胞過程中的作用 目的探討血管內皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)在骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bonemorphogeneticprotein-2，BMP-2)誘導成骨過程中的作用。 方法(1)取小鼠胚胎成骨細胞進行體外培養(yǎng)，RT-PCR法檢測rhBMP-2(300ng/ml)誘導成骨細胞分化過程中VEGF受體(VEGFreceptors，VEGF-R)的表

14、達。(2)采用VEGF反義寡核苷酸和蘇拉明分別阻斷VEGF的合成及功能，觀察對成骨細胞堿性磷酸酶(alkalinephosphataseactivities，AP)活性和鈣結節(jié)形成的影響。(3)在rhBMP-2誘導成骨的同時，添加不同濃度的外源性VEGF，觀察對成骨細胞體外礦化能力的影響。 結果(1)RT-PCR法可檢測到VEGF-R(Flk-1和Flt-1)mRNA在成骨細胞呈穩(wěn)定弱表達，rhBMP-2干預24h后VEGF-R

15、的表達量無明顯變化。(2)應用VEGF反義寡核苷酸(VEGFantisenseoligodeoxynucleotides，VEGFASODNs)和蘇拉明阻斷VEGF的合成和功能后，可抑制rhBMP-2所誘導的AP活性和鈣結節(jié)形成，并存在劑量依賴效應。(3)用不同濃度的VEGF干預成骨細胞發(fā)現，單獨VEGF并不能使成骨細胞分化為鈣結節(jié)，外源性VEGF的加入亦不影響rhBMP-2刺激鈣結節(jié)形成的能力。 結論VEGF在成骨細胞可以自分