CMTM3在食管鱗癌中的表達(dá)及其對(duì)預(yù)后影響的相關(guān)研究.pdf

1、前言:
　　在世界范圍內(nèi)，食管癌是所有人類惡性腫瘤中惡性程度最高的腫瘤之一，在人類高發(fā)腫瘤死亡率的排名中處于第六位。在所有食管癌的分型中，食管鱗癌的發(fā)生率超過百分之九十。食管鱗癌是一種起源于食管上皮細(xì)胞的惡性程度很高的腫瘤，它的發(fā)生率在全球范圍內(nèi)是非常高的，特別是在中國(guó)。盡管目前對(duì)于食管癌的診斷和治療的方法已經(jīng)照比從前改善很多，但是對(duì)于大多數(shù)食管癌患者來講還是存在著發(fā)現(xiàn)即是晚期的尷尬局面，這也就意味著他們失去了手術(shù)根治的機(jī)會(huì)。因此

2、，研究食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展途徑，尋找有關(guān)其早期診斷、病情監(jiān)測(cè)、預(yù)后判斷的新指標(biāo)和可靠的、特異性高的食管癌治療靶點(diǎn)，提高食管癌患者生存率和降低死亡率，是目前食管癌研究中至關(guān)重要的課題。
　　Human chemokine-like factor(CKLF)-like MARVEL transmembrane domain-containing family(CMTM)為CKLF樣MARVEL穿膜結(jié)構(gòu)域超家族，是由我國(guó)北京大學(xué)的人類疾病

3、基因研究中心首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道的一個(gè)新基因家族。在人類中，CMTM家族包括9個(gè)成員，即CKLF和CMTM1-8。目前研究表明，CKLF樣MARVEL穿膜結(jié)構(gòu)域超家族蛋白在人類的免疫系統(tǒng)、男性的生殖系統(tǒng)、和致腫瘤因素中起到非常重要的作用。CMTM3是CMTM家族中的一員，其分子結(jié)構(gòu)介于經(jīng)典的趨化因子和四次跨膜蛋白超家族之間。在四次跨膜蛋白超家族(transmem-brane4 super family，TM4SF)中，存在著許多成員與腫瘤的發(fā)

4、生相關(guān)，如TM4SF中的Plasmolipin、MAL與BENE蛋白，而且他們?cè)谇傲邢侔┖褪彻馨┲卸颊宫F(xiàn)了很強(qiáng)的腫瘤抑制作用。CMTM3位于染色體16q22.11，目前有研究表明其在很多惡性腫瘤中都存在表達(dá)缺失，如前列腺癌和口腔鱗狀細(xì)胞癌和睪丸癌中都存在低表達(dá)的情況。所以基于目前的研究，在惡性腫瘤中，CMTM3很可能扮演著腫瘤抑制基因的角色。然而在食管癌中，其表達(dá)對(duì)食管癌預(yù)后影響和臨床特征之間的關(guān)系還不甚了解，值得我們進(jìn)行探究。

5、　　目的:
　　本研究旨在探討CMTM3在食管鱗癌組織和食管鱗癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況以及與食管鱗癌發(fā)生發(fā)展與臨床病理學(xué)特征及預(yù)后的關(guān)系，為其在臨床治療中提供新的思路及依據(jù)。研究的第一部分我們利用免疫組化實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)CMTM3在食管鱗癌組織中的表達(dá)，分析其與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系及對(duì)患者預(yù)后的影響;在研究的第二部分中，我們通過實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)和Western blot技術(shù)來檢測(cè)20組成對(duì)食管癌和癌旁組織在mRNA和蛋白水平中CMTM3的

6、表達(dá)情況，分析其表達(dá)差異;研究的第三部分，通過對(duì)食管鱗癌細(xì)胞株KYSE-50中CMTM3的過表達(dá)，運(yùn)用MTT和Transwell技術(shù)來觀察其對(duì)食管鱗癌增殖、侵襲能力的影響，揭示CMTM3與食管鱗癌發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系，探討CMTM3潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　方法:
　　1、實(shí)驗(yàn)對(duì)象
　　本次試驗(yàn)中用于免疫組化研究的組織包括110例石蠟包埋的食管鱗癌組織和36例食管鱗癌癌旁組織，它們都來自于2008年5月到2010年

7、4月中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胸外科行手術(shù)治療的患者，并且術(shù)前沒有經(jīng)歷過化療。20對(duì)食管鱗癌及其癌旁組織的新鮮組織標(biāo)本取自于2014年4月到2014年8月之間在中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)的部分食管鱗癌患者。此外還包含1個(gè)正常食管鱗癌細(xì)胞株HEEC和2個(gè)食管鱗癌細(xì)胞株KYSE-50和KYSE-390。
　　2、實(shí)驗(yàn)方法
　　(1)免疫組織化學(xué)方法:檢測(cè)110例食管鱗癌組織及36例食管鱗癌癌旁組織中CMTM3蛋白的表達(dá)情況。

8、
　　(2)Western blot方法:檢測(cè)CMTM3蛋白在20對(duì)食管鱗癌組織及它們相對(duì)應(yīng)的癌旁組織中的表達(dá)情況。
　　(3)實(shí)時(shí)定量PCR方法:檢測(cè)CMTM3基因在20對(duì)食管鱗癌組織及它們相對(duì)應(yīng)的癌旁組織中的表達(dá)。
　　(4)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法:利用真核質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法上調(diào)食管鱗癌細(xì)胞株KYSE-50中CMTM3的表達(dá)含量。
　　(5) MTT方法:檢測(cè)CMTM3過表達(dá)后食管鱗狀細(xì)胞癌的細(xì)胞增殖能力的變化情況。<

9、br>　　(6) Transwell實(shí)驗(yàn):檢測(cè)CMTM3過表達(dá)后食管鱗狀細(xì)胞癌的細(xì)胞侵襲能力的變化情況。
　　(7)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù):對(duì)食管鱗癌細(xì)胞株常規(guī)培養(yǎng)。
　　結(jié)果
　　1、CMTM3在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義
　　(1)免疫組化檢測(cè)的結(jié)果顯示，在110例食管鱗狀細(xì)胞癌組織中，有79例食管鱗癌組織存在CMTM3的低表達(dá)，占總數(shù)的71.82％;有31例對(duì)CMTM3表現(xiàn)為高表達(dá)，占總數(shù)的28.18％。在36

10、例癌旁的組織中，27例組織存在CMTM3的高表達(dá)，占總數(shù)的75％。
　　(2)結(jié)合臨床資料進(jìn)一步研究表明，CMTM3的表達(dá)與患者的年齡(P=0.280)、性別(P=0.275)、腫瘤發(fā)生位置(P=0.357)和腫瘤分化程度(P=0.730)無關(guān)，但是結(jié)果顯示其低表達(dá)與腫瘤高分期、淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P＜0.01)。
　　2、CMTM3在新鮮食管癌及癌旁組織的基因和蛋白水平表達(dá)情況及在食管鱗癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況
　　

11、(1)我們的檢查發(fā)現(xiàn)，在20對(duì)新鮮食管鱗癌及癌旁組織中，有15對(duì)癌組織的CMTM3基因的表達(dá)低于其所對(duì)應(yīng)的癌旁組織，占總數(shù)的75％(15/20，P＜0.05)。
　　(2)同樣，在對(duì)成對(duì)樣本中的CMTM3蛋白水平含量進(jìn)行檢測(cè)后，我們的結(jié)果顯示，20對(duì)新鮮食管鱗癌及癌旁組織中，有15對(duì)癌組織的CMTM3蛋白的表達(dá)低于其所對(duì)應(yīng)的癌旁組織，占總數(shù)的75％(15/20，P＜0.05)。
　　(3)對(duì)于細(xì)胞中CMTM3蛋白含量的結(jié)果檢

12、測(cè)顯示，CMTM3在人正常食管粘膜細(xì)胞系HEEC中的表達(dá)高于食管鱗癌細(xì)胞系KYSE-390和KYSE-50，其中鱗癌細(xì)胞系KYSE-50中CMTM3的表達(dá)低于KYSE-390。
　　(4)在食管癌和癌旁組織中，CMTM3在基因和蛋白水平上表達(dá)都降低。
　　3、CMTM3過表達(dá)后對(duì)食管鱗癌細(xì)胞增殖、侵襲的影響
　　(1)我們的研究結(jié)果顯示，上調(diào)食管鱗癌細(xì)胞系KYSE-50中的CMTM3后，其增殖能力得到了顯著的抑制。

13、r>　　(2)在細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中，Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)CMTM3后的KYSE-50細(xì)胞的侵襲能力顯著降低，結(jié)論具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　1、CMTM3在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)與腫瘤臨床分期等臨床病理特征密切相關(guān)，且其表達(dá)情況與患者的預(yù)后生存率相關(guān)。
　　2、與癌旁組織相比，CMTM3在食管鱗狀細(xì)胞癌組織及食管鱗癌細(xì)胞系中均呈低表達(dá)。
　　3、過表達(dá)CMTM3可使食管鱗癌細(xì)胞KYSE-5