通心絡(luò)通過調(diào)節(jié)miR-29a抑制平滑肌細胞的增殖的作用機制.pdf

1、目的：血管新生內(nèi)膜的形成主要與血管內(nèi)皮屏障受損，平滑肌細胞的異常增殖和遷移有關(guān)。miRNA-29a是 miRNA-29家族中的一員，在體內(nèi)表達豐富，幾乎所有的細胞內(nèi)均有表達。miRNA-29a參與腫瘤形成、細胞因子分泌、免疫炎癥反應(yīng)等多個過程。在心血管系統(tǒng)中miRNA-29a不但參與心肌纖維化，還與動脈粥樣硬化的形成密切相關(guān)。但miRNA-29a在平滑肌細胞增殖方面的作用機制尚不清楚。通心絡(luò)(TXL)是一種中藥復方制劑，主要功效為益氣活

2、血，通絡(luò)止痛。用于冠心病心絞痛屬心氣虛乏、血瘀絡(luò)阻證者。通心絡(luò)治療心血管疾病已經(jīng)取得了顯著的療效。但TXL作為一種中藥，其發(fā)揮作用的機制復雜多樣。本文主要進一步研究通心絡(luò)抑制平滑肌細胞增殖和遷移的機制。
　　方法：⑴小鼠被隨機分為對照組，miR-29awt頸動脈結(jié)扎組，miR-29a+/+頸動脈結(jié)扎組，miR-29awt頸動脈結(jié)扎+通心絡(luò)灌胃組，miR-29a+/+頸動脈結(jié)扎+通心絡(luò)灌胃組。對頸總動脈進行蘇木精一伊紅染色觀察血管內(nèi)

3、膜增生的形態(tài)學變化，免疫組織化學染色觀察頸動脈增生內(nèi)膜中 PCNA的表達量。免疫熒光雙重染色檢測YY1和CyclinD1在小鼠頸動脈血管壁中的表達。⑵體外培養(yǎng)人血管平滑肌細胞，分別轉(zhuǎn)染miR-29a mimic和miR-29a inhibitor或給予通心絡(luò)預孵育，Real time PCR檢測 miR-29a的表達水平，Western Blot檢測PCNA，YY1和CyclinD1表達水平。細胞遷移實驗檢測血管平滑肌細胞在過表達miR

4、-29a后的遷移情況。
　　結(jié)果：①小鼠隨機分為三組：對照組、miR-29awt頸動脈結(jié)扎組、miR-29a+/+頸動脈結(jié)扎組。HE染色結(jié)果顯示，miR-29a+/+小鼠組新生內(nèi)膜增生更為明顯，其I/M比值和內(nèi)膜面積均明顯高于miR-29awt小鼠組。免疫組織化學染色結(jié)果顯示，miR-29a+/+小鼠組PCNA陽性顆粒明顯高于其它兩組。以上結(jié)果表明，miR-29a過表達促進頸動脈結(jié)扎誘導的內(nèi)膜增生。體外培養(yǎng)的人血管平滑肌細胞（HV

5、SMCs）分別轉(zhuǎn)染 miR-29a mimic（類似物）和miR-29a inhibitor（抑制劑）。Western Blot結(jié)果顯示，過表達miR-29a后，PCNA蛋白表達量增高。敲低miR-29a后，PCNA蛋白表達明顯降低。細胞劃痕實驗進一步發(fā)現(xiàn)，過表達miR-29a還可以促進平滑肌細胞的遷移。以上結(jié)果表明，在體外miR-29a促進VSMCs的增殖和遷移。②免疫雙熒光染色，與miR-29awt小鼠相比， miR-29a+/+小

6、鼠中YY1表達降低，Cyclin D1表達升高。體外培養(yǎng)的 HVSMCs，分別轉(zhuǎn)染 miR-29a mimic和 miR-29a inhibitor。Western Blot結(jié)果顯示，過表達miR-29a抑制YY1表達，促進CyclinD1表達。以上結(jié)果提示miR-29a通過下調(diào)YY1，同時上調(diào)Cyclin D1的表達，促進平滑肌細胞的增殖。③小鼠隨機分為四組：miR-29awt頸動脈結(jié)扎組、miR-29awt頸動脈結(jié)扎+通心絡(luò)組，mi

7、R-29a+/+頸動脈結(jié)扎組，miR-29a+/+頸動脈結(jié)扎+通心絡(luò)組。HE染色結(jié)果顯示，miR-29a+/+小鼠+通心絡(luò)灌胃組與單純 miR-29a+/+小鼠結(jié)扎組相比，I/M比值和內(nèi)膜面積均顯著降低。免疫雙熒光染色結(jié)果顯示， miR-29a+/+小鼠+通心絡(luò)灌胃組與單純 miR-29a+/+小鼠結(jié)扎組相比 PCNA表達量顯著下降。Western Blot結(jié)果與免疫熒光結(jié)果一致。體外培養(yǎng)的HVSMCs用通心絡(luò)預孵育后，再過表達miR-

8、29a。劃痕實驗結(jié)果顯示，通心絡(luò)可以抑制過表達miR-29a后平滑肌細胞的遷移。④Real time PCR結(jié)果顯示，通心絡(luò)能顯著降低miR-29a在血管平滑肌細胞的表達。免疫雙熒光染色結(jié)果顯示 miR-29a+/+小鼠+通心絡(luò)灌胃組YY1表達量明顯高于單純miR-29a+/+小鼠組。而CyclinD1的表達與YY1正相反。Western Blot結(jié)果與免疫熒光結(jié)果一致。以上結(jié)果表明，通心絡(luò)通過抑制miR-29a，從而上調(diào)YY1，抑制C

9、yclinD1的表達來實現(xiàn)其抑制平滑肌細胞增殖的作用。
　　結(jié)論：⑴miR-29a在體內(nèi)和體外均促進血管平滑肌細胞(VSMCs)的增殖和遷移。⑵miR-29a通過下調(diào)YY1，上調(diào)Cyclin D1的表達，促進平滑肌細胞的增殖。⑶通心絡(luò)在體內(nèi)和體外均能抑制平滑肌細胞的增殖和遷移，并能逆轉(zhuǎn)miR-29a對平滑肌細胞的促增殖和遷移作用。⑷通心絡(luò)通過抑制miR-29a，上調(diào)YY1，抑制CyclinD1的表達來實現(xiàn)其抑制平滑肌細胞增殖的作用