縮宮素對大鼠十二指腸肌間神經(jīng)叢AH神經(jīng)元電生理特性的影響及其機制.pdf

1、目標:
　　 經(jīng)典的觀點認為縮宮素(oxytocin，OT)是下丘腦垂體分泌的九肽激素，其主要生理作用是促進子宮平滑肌收縮并調(diào)節(jié)泌乳反射。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)OT具有調(diào)節(jié)消化道運動和分泌的功能，可能是一種新的胃腸神經(jīng)肽。我們最新的研究發(fā)現(xiàn)OT可通過腸神經(jīng)叢抑制大鼠十二指腸縱行肌的自發(fā)收縮，但其機制尚不清楚。肌間神經(jīng)元根據(jù)電生理特性可分為AH和S神經(jīng)元兩種類型，AH神經(jīng)元為內(nèi)在感覺神經(jīng)元(intrinsicprimaryaf

2、ferentneurons，IPANs)，而S神經(jīng)元為中間和運動神經(jīng)元。在預(yù)實驗中，我們發(fā)現(xiàn)OT可使全部的AH神經(jīng)元(25/25)和部分S神經(jīng)元(10/30)膜電位發(fā)生超極化，因此我們推測OT抑制十二指腸的運動可能與其調(diào)節(jié)AH神經(jīng)元的活動有關(guān)。本課題的主要目的是研究OT對AH神經(jīng)元電生理特性的影響及其機制。
　　 方法:
　　 將大鼠頸部脫臼處死，快速取出約1cm長的一段十二指腸，沿腸系膜剖開，粘膜面向上展開固定在盛有柯

3、氏液的硅膠盤中。在解剖鏡下用顯微器械將粘膜、粘膜下層和環(huán)形肌依次剝離，剩余部分即為縱行肌-肌間神經(jīng)叢標本(longitudinalmusclemyentericplexus，LMMP)。將LMMP標本置于含10mg/ml木瓜蛋白酶的柯氏液中37℃消化50min，將組織剪碎后再置于含1mg/ml膠原酶Ⅱ的DMEM培養(yǎng)基中37℃消化55min，用玻璃吸管吹打約30次，1000r/min離心6min，棄去上清，用1ml含10％胎牛血清的DME

4、M將沉淀懸浮，37℃培養(yǎng)，16h-24h后通過膜片鉗全細胞記錄模式分析OT對其膜電位和細胞膜上離子通道的影響;通過鈣成像方法監(jiān)測加入OT前后肌間神經(jīng)元胞漿中Ca2+濃度的改變;通過ELISA的實驗方法檢測LMMP標本中IP3含量及OT釋放量;通過免疫熒光雙標觀察OT受體(OTR)、BK通道α亞基、胞漿中OT及IPANs的標記物calbindin28K在神經(jīng)元上的表達情況。
　　 實驗結(jié)果:
　　 1、OT對AH神經(jīng)元膜電

5、位的影響
　　 AH神經(jīng)元的靜息電位為-54mV±1mV（n=30），連續(xù)給藥15s后，濃度在10-7M-10-5M的OT均使膜電位發(fā)生超極化，幅度分別為4.4mV±0.5mV(P＜0.05,n=9;OT10-7M),12.7mV±0.7mV(P＜0.05,n=8;OT10-6M)和8.9mV±0.8mV(P＜0.05，n=8;OT10-5M)。將AH神經(jīng)元用OTR阻斷劑atosiban(10-6M)孵育1min之后再給予OT，

6、原本OT誘發(fā)的超極化反應(yīng)基本消失。
　　 2、OT對AH神經(jīng)元動作電位參數(shù)的影響
　　 連續(xù)給予OT（10-6M）60s之后，AH神經(jīng)元的1/2動作電位時程(actionpotentialhalfwidth,AP1/2)由3.2ms±0.4ms降至2.9ms±0.3ms(P=0.04，n=12)，閾刺激(threshold)由69mV±10mV增至130mV±21mV(P=0.02，n=12)，去極化速率(actionp

7、otentialmaximaldepolarization，APdv/dt)及動作電位幅度（actionpotentialamplitude，APamp）均不發(fā)生改變。
　　 3、OT對AH神經(jīng)元外向離子流的影響
　　 在膜片鉗電壓鉗模式下，設(shè)置一個100ms的step，將鉗制電位從-80mV升至+50mV，觀察激發(fā)出的外向離子流。連續(xù)給藥60s后，三種濃度的OT均使這種外向離子流增加，增加的幅度分別為552pA±72p

8、A(P＜0.05，n=8;OT10-7M)，1035pA±122pA(P＜0.05，n=8;OT10-6M)和1116pA±100pA(P＜0.05，n=8;OT10-5M)。若將細胞先用BK通道(largeconductancecalcium-activatedpotassiumchannels)的阻斷劑IbTX孵育1min再加入OT，原本OT引起的外向離子流增加的現(xiàn)象基本消失。但IK通道(intermediateconductanc

9、ecalcium-activatedpotassiumchannels)的阻斷劑clotrimazole和SK通道(smallconductancecalcium-activatedpotassiumchannels)的阻斷劑apamin均無此作用。
　　 為確定BK通道是否在AH神經(jīng)元上有功能性表達，進一步觀察BK通道的激動劑NS1619對外向離子流的影響，發(fā)現(xiàn)當膜電位牽制在+50mV時，NS1619可使其增大748pA±14

10、1pA(P=0.002，n=8)，該作用可完全被IbTX阻斷。
　　 4、OT對肌間神經(jīng)元中鈣離子濃度的影響
　　 OT可使12/30肌間神經(jīng)元胞漿中鈣離子濃度([Ca2+]i)升高。連續(xù)給藥50s后，[Ca2+]i升高到最大值，且分別在100s(10-7M)，150s(10-6M)和250s(10-5M)恢復(fù)到初始水平。三種濃度的OT作用50s分別使胞漿中鈣離子的相對濃度由基準值1升高至1.3±0.2(P＜0.05，1

11、0-7M;n=8)，1.3±0.2(P＜0.05，10-6M;n=11)和1.6±0.3(P＜0.05，10-5M;n=11)。
　　 為進一步確定胞內(nèi)增加的Ca2+的來源，我們將AH神經(jīng)元分別用鈣庫清空劑thapsigargin(10-6M)和細胞膜上非特異性的鈣離子通道阻斷劑CdCl2(5×10-5M)孵育10min，再加入OT，外向離子流的增加值分別由678pA±78pA降至182pA±34pA(P＜0.001，n=8;D

12、MSO+OTvs.thapsigargin+OT)，由1042pA±96pA降至440pA±94pA(P＜0.001,n=10;vehicle+OTvs.CdCl2+OT).
　　 5、OT致AH神經(jīng)元BK通道開放的信號通路
　　 將AH神經(jīng)元分別用IP3受體的阻斷劑2-APB(10-4M)和PLC的阻斷劑U73122(10-5M)孵育10min，均可部分逆轉(zhuǎn)OT引起外向離子流增加。LMMP標本在含OT（10-6M）的浴

13、液中孵育1min，其中的IP3含量由16.0ng/ml±1.1ng/ml增加至22.0ng/ml±1.4ng/ml(P=0.001，n=16)。用atosiban（10-6M）預(yù)處理之后再加入OT，IP3含量為16.8ng/ml±0.7ng/ml(P=0.003，n=16;OTvs.atosiban+OT)
　　 6、Atosiban和KCl對LMMP標本OT分泌量的影響
　　 將LMMP標本(20μg/300μl)在柯

14、氏液中孵育3min，OT分泌量為33.2ng/ml±2.6ng/ml(n=7)，向柯氏液中加入atosiban(10-6M)或KCl（2×10-6M），OT分泌量分別增至47.1ng/ml±3.5ng/ml(P=0.01，n=7;atosibantreatmentvs.control)和45.4ng/ml±2.5ng/ml((P=0.02,n=7;KC1treatmentvs.control)。同時向柯氏液中加入atosiban和KCl

15、，OT分泌量增至62.6ng/ml±5.0ng/ml(P=0.002,n=7,KCl+atosibanvs.KCl;P=0.005，n=7,KCl+atosibanvs.atosiban).
　　 7、OTR和BK通道在LMMP標本上的定位
　　 OTR在部分肌間神經(jīng)元細胞膜上表達，其中63/71陽性表達細胞呈圓形或橢圓形，近似于DogieltypeⅡ/AH神經(jīng)元的形狀。BK通道α亞基與OTR陽性表達細胞完全重合。

16、>　　 8、OT和calbindin28K在LMMP上的表達
　　 OT和AH神經(jīng)元的標記物calbindin28K均在部分LMMP的神經(jīng)元上表達。統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，73.1％(122/167)的OT陽性細胞上有calbindin28K表達，而82.4％(122/148)的AH神經(jīng)元上有OT表達。
　　 結(jié)論:
　　 OT作用于大鼠肌間神經(jīng)叢AH神經(jīng)元上的OT受體，激活細胞中的OTR-PLC-IP3-Ca2+信號通路，