甲狀旁腺激素的非PLC依賴PKC通路對骨代謝的研究.pdf

1、骨質疏松癥是一類伴隨年齡衰老或醫(yī)學原因一起的，以骨量丟失、骨密度降低、骨組織顯微結構破壞、骨脆性增加、骨強度下降，以及易于發(fā)生骨折為主要臨床特征的代謝性、全身性骨骼疾病。WHO于1994年制定了以骨密度測量為基礎，診斷骨質疏松的標準為骨密度值低于或等于正常年輕人2.5個標準差即可診斷為骨質疏松，有過一次或多次骨折經(jīng)歷的都肯定有嚴重的骨質疏松。隨著全球人口的老齡化，骨質疏松在全世界常見病、多發(fā)病中的地位逐漸上升至第七位。在我國骨質疏松癥也

2、已躍居常見病第六位，患病人數(shù)已達到9500萬。其中50～60歲的發(fā)生率為21％，60～70歲的為58％，70歲以上幾乎是100％，尤以絕經(jīng)后婦女的發(fā)生率更高，據(jù)調查顯示，50歲以上男性及40歲以上女性都有不同程度的骨質疏松，隨著年齡的增加，骨質疏松的發(fā)生率明顯增加。健康人的骨密度（礦物質含量）在30歲以前是上升的，并在30～39歲達到高峰，到40歲以后逐漸下降，礦物質量下降往往沒有感覺或者感覺輕微，只有在減少12％以上時才會出現(xiàn)變矮、駝

3、背、彎腰等臨床癥狀，并且隨著年齡的增加和礦物質含量的減少而加重。當患者發(fā)生骨折時，此時的礦物質含量丟失已達25％以上。目前治療骨質疏松的主要方法分為飲食治療和藥物治療，通過調整飲食結構、補充鈣劑及維生素D等具有一定的治療效果。藥物治療主要分為抑制骨吸收藥物和促進骨形成藥物，前者包括雌激素替代療法、降鈣素、維生素D及其代謝產物、二膦酸鹽、異黃酮衍生物等，后者有甲狀旁腺激素、氟化物、他汀類藥物、鈣劑、鍶鹽、男性激素治療等。在增加骨量促骨形成

4、的代謝藥物中，目前只有甲狀旁腺激素（商用名:特里帕肽）獲得認可。甲狀旁腺激素對骨代謝具有獨特的作用，這是其它藥物所不具備的。這些作用主要包括增加骨密度、促進骨微結構的重塑以及降低骨折的發(fā)生率。
　　甲狀旁腺激素(PTH)是調節(jié)骨代謝的重要激素之一。改變任何蛋白的氨基酸序列或者構象都會改變該蛋白的能力，PTH(1-34)也不例外，其構象的改變及氨基酸序列的變化都有可能影響某些信號通路的激活能力。如:PTH(1-34)完整的N端結構是

5、cAMP/PKA和PLC/PKC通路的激活的必要條件;Gly1替換Ser1可使PTH(1-34)失去激活PLC的特性;Arg19替換Glu19能夠補償因29-34氨基酸殘基缺失而引起的受體結合力減弱;當Leu24，Leu28，val31突變成Glu后，PTH(5-34)不與受體結合;在PTH(1-14)的氨基酸殘基中，Val2，Glu4，Ile5，Lys7，Met8，His9突變成Ala后，不能激活cAMP/PKA信號通路;在PTH(1

6、-34)中，Ile5，Glu19，Val21等位點的突變，嚴重干擾PTH(1-34)與受體的結合力;Aib1，3，Nle8，21，Gln10，Har11，Ala12，Trp14，Arg19構成的組合突變亦稱M突變，M突變可使PTH(1-14) cAMP的合成能力提高約40倍，PLC的激活能力提高66倍，與PTHR的結合力提高約10倍;[Nle8，18，Tyr34]PTH(3-34)可使PTH(3-34)擁有激活cAMP/PKA通路的能力

7、，但仍遠小于(10倍以上)PTH(1-34)激活cAMP的能力等;基于以上PTH模擬肽的結構特點，通過利用PKC激活的熒光能量共振轉移（FRET）技術，即通過加入不同的信號通路阻滯劑以及不同信號通路的模擬肽改變信號通路來觀察FRET效率以及青色熒光與黃色熒光強度的比值（C/Y）是否改變以及改變的強度，以此來判斷是否激活PKC。本課題組于近年設計和篩選出具有nonPLC/PKC通路特異性PTH模擬肽（簡稱MY1肽）。該MY1肽具有PTH/

8、nonPLC/PKC的激活能力，即1）MY1肽激活PKC是與PTHR結合后通過PTH/nonPLC/PKC通路實現(xiàn)的并且不依賴于cAMP和PLC信號通路的激活。2）PTH/nonPLC/PKC模擬肽MT1肽具有顯著增強成骨相關基因CITED1及ALP的作用。
　　我們前期的研究揭示:PTH經(jīng)nonPLC/PKC通路促進受力區(qū)松質骨合成，促進新骨形成，但是nonPLC/PKC通路的具體信號中介分子仍不清楚，相應的影響骨代謝的機理還需

9、要深入研究。最近研究發(fā)現(xiàn)，PTH短時間（1小時）刺激引起的細胞增值主要是由PKA通路主導的，而PKC通路主要參與PTH的長時間(24和48小時)的刺激從而導致細胞增殖的減少和凋亡的增加。但是對于PTH/nonPLC/PKC信號通路對于細胞的增殖與凋亡目前尚不清楚。既往本課題組通過注射PTH(1-34)與G1R19(1-34)對去勢小鼠骨折愈合的影響發(fā)現(xiàn):發(fā)現(xiàn)PTH(1-34)和G1R19(1-34)組骨密度明顯高于G1R19(1-28)

10、組且G1R19(1-34)組的骨小梁重建速度比G1R19(1-28)組更快，也就是PTH/nonPLC/PKC通路具有改善骨小梁結構和增加受力區(qū)松質骨骨量的效應?；赑TH的基本結構，我們設計和篩選了不依賴PKA及PLC信號轉導的特異性PTH/nonPLC/PKC信號通路選擇性模擬肽MY1肽，利用MY1肽干預去睪丸小鼠股骨骨折的進程以及對比其與PTH(1-34)對股骨骨折的愈合以及對骨質疏松骨代謝的差異，觀察該信號通路特異性模擬肽MY1

11、肽對于骨折愈合和骨質疏松骨代謝的影響，通過分析脛骨骨松質及骨皮質和股骨骨折端骨痂區(qū)的差異，進一步明確PTH/nonPLC/PKC通路對骨代謝的影響。
　　目的:
　　1.觀察甲狀旁腺激素的非依賴PLC的PKC轉導通路(PTH/nonPLC/PKC)是否會對成骨細胞(MC3T3E1)的凋亡以及細胞數(shù)量的影響。
　　2.在顯微CT上分析特異性PTH/nonPLC/PKC模擬肽對去勢骨折小鼠的脛骨骨小梁、骨皮質的影響及股骨骨

12、折的愈合情況，進一步了解nonPLC/PKC通路對骨代謝的影響。
　　方法:
　　培養(yǎng)MC3T3-E1細胞，以1.5×104密度接種到96孔板，然后置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)3天直到細胞達到匯合狀態(tài)，隨機分為5組:100nmol/LG1R19hPTH(1-28)組;100nmol/LG1R19hPTH(1-34)組;100nmol/LG1R19hPTH(1-34)+1μmol/L Go6983組，1μmol/LGo6983組;空白對照組

13、加入等體積的0.1％TFA(TFA為甲狀旁腺激素模擬肽的溶劑)，分別刺激細胞1小時，24小時，48小時，然后使用細胞計數(shù)試劑盒(CCK-8)和Caspase-Glo(R)3/7試劑盒(Caspase-3)檢測細胞的數(shù)量及凋亡情況。
　　結果:
　　通過分析細胞計數(shù)試劑盒(CCK-8)，結果顯示G1R19(1-34)組與G1R19(1-34)+Go6983組相比，在1小時及24小時具有提高細胞數(shù)量的趨勢，但結果沒有統(tǒng)計學差異，

14、48小時G1R19(1-34)組與G1R19(1-28)組相比，可以明顯提高細胞的數(shù)量(P＜0.05)。進一步的研究發(fā)現(xiàn)在G1R19(1-34)組添加抑制劑Go6983后，細胞數(shù)量增多的效應消失(P＜0.05)。Caspase-Glo(R)3/7試劑盒結果顯示，G1R19(1-34)組與G1R19(1-34)+Go6983組相比，在1小時及24小時具有抑制細胞凋亡，但是差異無統(tǒng)計學意義。48小時檢測凋亡顯示，G1R19(1-34)組與G

15、1R19(1-28)組相比，前者可以明顯抑制細胞的凋亡(P＜0.05)，給予PKC抑制劑Go6983后，這種抑制凋亡的現(xiàn)象消失。
　　通過切除小鼠睪丸，制造骨質疏松模型，1周后再次進行手術橫切股骨中段，造成骨質疏松股骨骨折模型。藥物刺激2周及4周后，處死小鼠，血清學檢測分析顯示，MY1肽組與空白對照組相比，鈣離子及ALP明顯升高并且具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。顯微CT分析得，在2周及4周時，MY1肽組與空白對照組相比，其具有改

16、善骨小梁結構并且提高骨小梁的骨密度及骨量，同時也會提高脛骨骨皮質周徑并且能夠促進骨折的愈合。
　　結論:
　　1.初步發(fā)現(xiàn)PTH的nonPLC/PKC信號轉導通路可能在長時間（48小時）作用于MC3T3-E1細胞時，會抑制成骨細胞，增加成骨細胞數(shù)量。這有益于我們加深對PTH/nonPLC/PKC通路的理解，并為甲狀旁腺激素對骨質疏松的治療增添了新的研究方向。
　　2.nonPLC/PKC通路具有改善骨小梁結構且促進受力