2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、甲狀旁腺素(PTH)是目前應用于臨床的唯一促骨形成藥物,它可以有效增加骨量,治療骨質(zhì)疏松及骨質(zhì)疏松性骨折、關(guān)節(jié)假體松動及長期使用二磷酸鹽引起的非典型骨折等。
  PTH激活不同的信號通路與其自身的多肽結(jié)構(gòu)密不可分,任何氨基酸的突變及構(gòu)象的改變都有可能導致某些信號通路激活能力的缺失。研究證實,改變PTH的氨基酸序列能改變PTH的信號轉(zhuǎn)導特征,如PTH(1-34)片段中,1-3位的氨基酸決定PTH的cAMP/PKA和PLC信號通路的激

2、活功能;Ser1變成Gly1可使得PTH(1-34)失去激活PLC的能力;第19位氨基酸Glu19變成Arg19能夠補償29-34氨基酸殘基缺失引起的受體結(jié)合力減弱;Leu24,Leu28,va131突變成Glu后,PTH(5-34)不與受體結(jié)合;Aib1,3,Nle8,21,Gln10,Har11,Ala12,Trp14,Arg19構(gòu)成的組合突變亦稱M突變,M突變可使PTH(1-34)的cAMP合成能力提高約40倍,PLC的激活能力提

3、高66倍,與PTHR的結(jié)合力提高約10倍;在PTH(1-34)中,Ile5,Glu19,Val21等位點的突變嚴重干擾PTH(1-34)與受體的結(jié)合力; PTH(1-34)第1、3位氨基酸突變成氨基異丁酸(Aib)后促進與PTHR的結(jié)合和cAMP的形成。根據(jù)以上模擬肽結(jié)構(gòu)的研究基礎(chǔ),我們擬通過氨基酸突變的方法來達到基本不影響PTH肽與受體結(jié)合能力,屏蔽cAMP/PKA和PLC激活能力的目的,設計nonPLC/PKC通路特異性PTH模擬肽

4、的序列。
  我們的前期研究也表明,Gly1Arg19hPTH(1-28)(GR(1-28))和Gly1Arg19hPTH(1-34)(GR(1-34))均失去了激活PLC的能力,但GR(1-34)仍可激活PKC,而GR(1-28)卻沒有這樣的作用,即PTH可以通過nonPLC/PKC通路激活PKC,且功能區(qū)域是PTH(29-34)片段。通過C57BL小鼠皮下注射觀察發(fā)現(xiàn),GR(1-34)顯著增加骨量,尤其是受力的松質(zhì)骨區(qū)域,顯著

5、強于GR(1-28)的作用,盡管后者具有與前者相同的cAMP激活特性,提示PTH作用下nonPLC/PKC通路的激活能夠促進受力區(qū)松質(zhì)骨合成,改善骨小梁微結(jié)構(gòu),促進新骨的形成。近期我們發(fā)現(xiàn)GR(1-34)具有比PTH(1-34)和GR(1-28)更強的促進脊柱融合的作用,具有一定通路選擇性的PTH模擬肽具有較PTH更好的促骨形成作用和改善骨微結(jié)構(gòu)的功能。但是nonPLC/PKC通路的具體信號介導分子仍不清楚,其對于骨代謝的作用機制仍需要

6、深入研究。因此我們擬設計和篩選nonPLC/PKC信號通路選擇性PTH模擬肽,并分析該通路特有的下游效應分子,進一步探討PTH通過nonPLC/PKC信號通路促進骨形成的作用機理。
  目的:
  利用原代成骨細胞,通過相關(guān)信號通路屏蔽和基因表達分析,篩選與核實甲狀旁腺激素29-34位蛋白結(jié)構(gòu)域(PTH(29-34))的效應基因,分析其對骨代謝的影響。以PTH結(jié)構(gòu)為模板,通過改變其氨基酸序列,構(gòu)建nonPLC/PKC信號通路

7、選擇性PTH模擬肽,并在相關(guān)通路阻滯劑與激活劑的干擾下利用FRET技術(shù)和ELISA法對其信號特征進行驗證核實。并研究新肽對成骨相關(guān)基因的影響,探究PTH/nonPLC/PKC通路的骨代謝功能。
  方法:
  2~3日齡C57BL乳鼠10只,取顱蓋骨分離培養(yǎng)成骨細胞,經(jīng)成骨誘導液培養(yǎng)14d和28d時分別進行ALP染色和茜素紅染色,鑒定原代成骨細胞。取貼壁生長的第1代細胞,分別接受100 nmol/L GR(1-28),10

8、nmol/L GR(1-34),10nmol/L PTH(1-34)及空白對照作用4h,提取總RNA,行小鼠全基因組表達譜芯片分析,進行相關(guān)通路分析,并篩選出可能與nonPLC/PKC信號轉(zhuǎn)導通路相關(guān)的差異表達基因。RT-PCR篩選及驗證上述差異表達基因。培養(yǎng)MC3T3-E1細胞,使用cAMP通路抑制劑(RP-cAMP)阻斷PTH誘發(fā)的cAMP/PKA信號通路,比較GR(1-28)和GR(1-34)引起的基因變化情況。
  構(gòu)建P

9、THR穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK293細胞,轉(zhuǎn)染CKAR報告分子后,利用PKC激活的熒光能量共振轉(zhuǎn)移(FRET)技術(shù),檢測PTHR穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞在cAMP通路抑制劑(RP-cAMP)干擾下分別接受GR(1-28)和GR(1-34)刺激下PKC的激活情況,確定PTH的nonPLC/PKC通路相關(guān)區(qū)域。
  以PTH氨基酸為基礎(chǔ),用氨基酸突變的方法增強nonPLC/PKC通路相關(guān)區(qū)域作用,合成PKA-PLC-PKC+肽(MY1肽)。用FRET技術(shù)檢測

10、MY1肽對轉(zhuǎn)染CKAR的PTHR穩(wěn)轉(zhuǎn)HEK293細胞中PKC的激活能力,并觀察加入PKC抑制劑(Go6983)后PKC激活的變化情況,檢測MY1肽作用下轉(zhuǎn)染CKAR的HEK293細胞(無PTHR)中PKC的激活情況,探究其與PTHR的關(guān)系。用ELISA法檢測MY1肽對MC3T3-E1細胞中cAMP、PLC激活能力。以驗證核實MY1肽為PTH的nonPLC/PKC通路特異性模擬肽。
  MC3T3-E1細胞分別接受10umol/L

11、MY1肽、10umol/L PTH(3-34)、100nmol/LPTH(1-34)及空白對照組作用4h,提取總RNA,RT-PCR檢測成骨相關(guān)基因的表達。
  結(jié)果:
  原代培養(yǎng)成骨細胞的形態(tài)較均一,呈梭形或多邊形。待細胞長滿后,見細胞排列緊密,呈鋪路石狀。成骨誘導培養(yǎng)14d,細胞排列緊密,呈復層生長,行ALP染色,鏡下顯示胞質(zhì)中出現(xiàn)藍色顆粒,成骨誘導培養(yǎng)至28d行茜素紅染色,鏡下顯示出現(xiàn)紅染的礦化結(jié)節(jié)。行小鼠全基因組芯

12、片檢測,通過相關(guān)通路分析,得到了最可能與PTH的nonPLC/PKC信號轉(zhuǎn)導途徑相關(guān)的14條信號通路。根據(jù)芯片結(jié)果,經(jīng)過進一步分析,我們挑選出了與PTH的nonPLC/PKC信號通路相關(guān)性最高的56個基因,作為RT-PCR篩選驗證的基因?qū)ο?。篩選的56個基因中,我們發(fā)現(xiàn)CITED1的表達量PTH(1-34)組明顯高于其他各組,且GR(1-34)組顯著高于GR(1-28)組,PTH(1-34)與GR(1-34)組均顯著高于空白對照組。MC

13、3T3-E1細胞經(jīng)各組模擬肽刺激后,提取總RNA,進行RT-PCR檢測,CITED1的表達量GR(1-34)組仍顯著高于GR(1-28)組,與原代成骨細胞實驗結(jié)果一致,且在加入PKC抑制劑后,CITED1表達量明顯下降,證實CITED1表達量的升高由nonPLC/PKC通道激活引起,不依賴PLC及PKA的激活。
  PTHR穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞經(jīng)PKC特異性激活劑TPA刺激后,PKC被激活,C/Y值顯著增高,表明我們檢測PKC激活的FRET技

14、術(shù)檢測平臺構(gòu)建成功,其可以作為后續(xù)試驗中檢測PKC激活的有效手段。PTHR穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞在PTH(1-34)的作用下,C/Y值顯著增高,即檢測到PKC被激活,表明我們成功地構(gòu)建了PTHR穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞。在轉(zhuǎn)染CKAR的PTHR穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞細胞中,阻斷cAMP通路后,GR(1-28)無法激活PKC,而GR(1-34)仍可激活PKC,nonPLC/PKC通路的激活與PTH的29至34氨基酸片段有關(guān)。在MY1肽作用下,F(xiàn)RET檢測顯示C/Y值明顯升高,PKC

15、被激活,而PTH(3-34)及空白對照中,PKC未被激活。在MY1肽刺激使C/Y值明顯升高后,加入PKC阻滯劑后,C/Y值明顯下降,并逐漸降至起始水平。轉(zhuǎn)染CKAR的HEK293細胞(無PTHR)在PTH(3-34)或是MY1作用下,C/Y值均未發(fā)生變化,而在加入TPA(PKC特異性激活劑)后,C/Y值明顯升高,PKC被激活。ELISA法檢測MC3T3-E1經(jīng)各模擬肽作用下cAMP、PLC的含量,實驗結(jié)果顯示,PTH(1-34)組中cA

16、MP、PLC含量明顯高于其它各組,而其它三組之間cAMP含量無統(tǒng)計學差異,即MY1肽沒有激活cAMP、PLC的能力。
  MC3T3-E1細胞經(jīng)各PTH模擬肽作用后行RT-PCR檢測,結(jié)果顯示MY1組CITED1的表達量明顯高于空白對照組和PTH(3-34)組,在加入PKC抑制劑Go6983后,CITED1的表達量明顯下降,與原代成骨細胞實驗中結(jié)果相一致。在成骨基因檢測中,ALP的表達量在MY1組明顯高于空白對照組和PTH(3-3

17、4)組,且在加入PKC抑制劑后,其表達量明顯下降。
  結(jié)論:
  1.原代成骨細胞培養(yǎng)成功,經(jīng)基因芯片分析,發(fā)現(xiàn)與PTH的nonPLC/PKC信號轉(zhuǎn)導途徑相關(guān)的14條信號通路。經(jīng)RT-PCR篩選,我們發(fā)現(xiàn)PTH(29-34)蛋白機構(gòu)域可通過PKC信號途徑促進CITED1的表達,介導PTH對成骨代謝的作用。該途徑不依賴PLC和PKA信號的激活。
  2.經(jīng)FRET分析,PTHR穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞成功建立,我們構(gòu)建的MY1肽具

18、有通過PTHR激活PKC的特性,且不依賴PKA及PLC信號轉(zhuǎn)導。表明MY1為PTH/nonPLC/PKC通路特異性模擬肽。MY1肽的建立為PTH/nonPLC/PKC的進一步研究奠定了基礎(chǔ),據(jù)我們所知,單純具有nonPLC/PKC的信號特征的PTH模擬肽國內(nèi)外未有報道。
  3.MY1肽促進轉(zhuǎn)錄因子CITED1和成骨基因ALP的表達,表明PTH的nonPLC/PKC通路至少通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子CITED1或成骨基因ALP的表達量參與骨

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