PLC非依賴(lài)PKC途徑介導(dǎo)PTH成骨作用的體外研究.pdf

1、背景:隨著社會(huì)老齡化的進(jìn)程，骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率逐年上升，并嚴(yán)重影響著老年人的身體健康。目前，治療骨質(zhì)疏松癥的藥物以抗骨質(zhì)吸收為主要作用，而對(duì)骨量的增加有限，近期來(lái)甲狀旁腺素(PTH)被證實(shí)具有可靠的抗骨質(zhì)疏松作用，可促進(jìn)皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨形成、增加骨密度、降低骨折發(fā)生率等，是目前臨床可靠的促進(jìn)骨合成代謝的藥物。但PTH的療效并不十分理想，主要是因?yàn)槠鋵?duì)骨組織具有雙向作用，這也與其激活多種信號(hào)通路有關(guān)。目前認(rèn)為PTH主要激活三條信號(hào)通路:cA

2、MP/PKA、PLC/PKC和nonPLC/PKC通路。既往研究發(fā)現(xiàn)，cAMP/PKA通路是PTH骨作用的主要機(jī)制，但有雙向作用，PLC/PKC通路有輔助增強(qiáng)PTH的破骨作用，而nonPLC/PKC通路具有成骨部位特異性。目前，信號(hào)通路的研究主要通過(guò)檢測(cè)蛋白激酶的活化，蛋白激酶活化的檢測(cè)方法主要有細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)位、絲蘇氨酸殘基的磷酸化及特殊底物磷酸化，這些方法缺乏直接性及靈敏性。而熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)技術(shù)近年來(lái)被廣泛用于信號(hào)通路的研究

3、，具有直接靈敏的特性。Newton等首先報(bào)道了檢測(cè)PKC活化的FRET系統(tǒng)，在CFP和YFP之間插入了特異性PKC作用底物和FHA2磷酸化肽段的結(jié)合域;PKC-delta激活報(bào)告分子與其類(lèi)似，插入了特異性PKC-delta作用底物和FHA2磷酸化肽段的結(jié)合域。當(dāng)轉(zhuǎn)染了兩種質(zhì)粒的細(xì)胞表達(dá)出CKAR分子和PKC-delta報(bào)告分子時(shí)，在共聚焦顯微鏡下根據(jù)熒光強(qiáng)度的相對(duì)改變(C/Y)就可以判斷刺激物是否激活了PKC或PKC-delta。

4、>　　 目的:提取、純化及鑒別目的質(zhì)粒:CKAR、PKC-delta、PTHR1及DSEL，再通過(guò)FRET技術(shù)及共聚焦顯微鏡證明PKC或PKC-delta活化的FRET系統(tǒng)可用于信號(hào)通路的研究，并探討nonPLC/PKC通路是否有其他途徑的參與，以及它們之間的關(guān)系。
　　 方法:運(yùn)用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌，擴(kuò)增目的質(zhì)粒，并通過(guò)堿裂解法從大腸桿菌中提取質(zhì)粒，再通過(guò)質(zhì)粒提取試劑盒純化質(zhì)粒。通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)量其濃度和純度，經(jīng)酶切及凝

5、膠電泳鑒定質(zhì)粒。
　　 運(yùn)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法分別將CKAR或PKC-delta質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)HEK293細(xì)胞體內(nèi)，培養(yǎng)48h后通過(guò)共聚焦顯微鏡分析CKAR或PKC-delta質(zhì)粒是否可在細(xì)胞內(nèi)正常表達(dá)以及在佛波酯(TPA)的刺激下FRET效率及青色熒光與黃色熒光強(qiáng)度的比值(c/Y)是否改變，判斷它們是否具備檢測(cè)PKC或PKC-delta活化的功能。
　　 PTHR1是PTH的野生型受體，與PTH結(jié)合后激活三個(gè)通路，而DSEL為人

6、工合成的突變型受體，其與PTH結(jié)合后不能激活PLC/PKC通路。將PTHR1或DSEL質(zhì)粒與CKAR質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染進(jìn)HEK293細(xì)胞，培養(yǎng)72h后通過(guò)共聚焦顯微鏡觀察PTH(1-34)是否可引起CKAR分子發(fā)生FRET改變，并與不轉(zhuǎn)染受體質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞作對(duì)比，以此判斷PTHR1和DSEL質(zhì)粒是否可在細(xì)胞內(nèi)成功表達(dá)以及其所表達(dá)的蛋白是否具有功能。
　　 目前認(rèn)為，PTH(1-34)具備全段PTH的活性，cAMP/PKA、PLC

7、/PKC和nonPLC/PKC三個(gè)途徑均可激活;G1R19(1-34)不激活PLC/PKC通路;G1R19(1-28)可激活cAMP/PKA通路，不激活PL/PKC通路，而對(duì)nonPLC/PKC通路的激活存在爭(zhēng)議。分別使用這三種不同的甲狀旁腺素信號(hào)選擇性類(lèi)似肽刺激共轉(zhuǎn)染PTHR1或DSEL質(zhì)粒和CKAR或PKC-delta質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞，培養(yǎng)72h后通過(guò)共聚焦顯微鏡觀察FRET的改變，判斷甲狀旁腺素對(duì)PKC的激活情況，并從多個(gè)角

8、度出發(fā)探索甲狀旁腺素的信號(hào)通路。
　　 結(jié)果:擴(kuò)增各質(zhì)粒，并用質(zhì)粒提取試劑盒提取及純化目的質(zhì)粒，用紫外分光光度計(jì)測(cè)量質(zhì)粒的純度和濃度，PKC-delta、CKAR、PTHR1和DSEL質(zhì)粒的A260/A280分別為1.94、1.93、1.93和1.91，濃度分別為431.4、456.3、501.8和522.6ng/μl。經(jīng)不同限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)四種質(zhì)粒酶切后，凝膠電泳顯示質(zhì)粒片段均在相應(yīng)的理論值范圍。
　　 在培養(yǎng)體系中加入

9、終濃度200nmol/L的TPA后，在表達(dá)CKAR和PKC-delta報(bào)告分子的HEK293細(xì)胞，CFP的發(fā)射光增強(qiáng)，YFP的發(fā)射光減弱，相應(yīng)的FRET效率下降，青色與黃色熒光強(qiáng)度的比值(C/Y)明顯增大。
　　 在未轉(zhuǎn)染甲狀旁腺素受體質(zhì)粒(PTHR1或DSEL)的細(xì)胞，10μmol/L的PTH(1-34)未能明顯改變C/Y的值，而在轉(zhuǎn)染有PTH受體的細(xì)胞內(nèi)，100nmol/L的PTH(1-34)即可使C/Y明顯增大。
　

10、　 在轉(zhuǎn)染CKAR質(zhì)粒并表達(dá)PTHR1或DSEL受體的HEK293細(xì)胞，0.1％TFA作為三種肽的溶劑，均未能引起C/Y的改變，100nmol/L的PTH(1-34)、100nmol/L的G1R19(1-34)及1μnol/LG1R19(1-28)均使C/Y明顯增加。在轉(zhuǎn)染PKC-delta質(zhì)粒并表達(dá)PTHR1或DSEL受體的HEK293細(xì)胞，具有同樣的結(jié)果，0.1％TFA均未能引起C/Y的改變，100nmol/L的PTH(1-34)

11、、100nmol/L的G1R19(1-34)及1μmol/LG1R19(1-28)均使C/Y明顯增加。在轉(zhuǎn)染CKAR或PKC-delta質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞，100μmol/L的8Br-cAMP未引起C/Y的改變。
　　 結(jié)論:1.CKAR和PKC-delta質(zhì)粒可以在活細(xì)胞內(nèi)成功表達(dá)并且具備檢測(cè)PKC或PKC-delta活化的功能，提示該方法是一種靈敏可靠的PKC活性檢測(cè)模型。2.PTH可通過(guò)PLC非依賴(lài)途徑激活PKC，而c