siRNA干擾Arf6對人前列腺癌PC-3細(xì)胞株增殖、遷移和侵襲的影響及分子機(jī)制研究.pdf

1、前列腺癌(prostate cancer，PCa)是男性最常見的惡性腫瘤之一，研究與前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲相關(guān)的基因及分子作用機(jī)制，將為探索轉(zhuǎn)移性前列腺癌藥物治療新靶點(diǎn)提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　ADP核糖基化因子(ADP-ribosylation factor，Arf)是Ras基因超家族成員，因Arf能夠變構(gòu)激活霍亂毒素，增強(qiáng)霍亂毒素的ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性，促進(jìn)霍亂毒素對Gs蛋白α亞基ADP-核糖基化作用而被發(fā)現(xiàn)。ADP核

2、糖基化因子6(ADP-ribosylation factor6，Arf6)是Arf蛋白家族中最特殊的亞型，分子量約為20KD，主要分布于細(xì)胞膜和內(nèi)涵體膜。在細(xì)胞膜內(nèi)吞、胞外分泌、內(nèi)涵體循環(huán)、細(xì)胞分裂、微囊泡運(yùn)輸和釋放、細(xì)胞間粘附連接的形成和肌動蛋白細(xì)胞骨架重構(gòu)等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。關(guān)于Arf6調(diào)節(jié)各類腫瘤細(xì)胞運(yùn)動、侵襲和遷移的具體作用機(jī)制尚不明確。研究發(fā)現(xiàn)Arf6調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖與PI3K/AKT信號通路活化相關(guān)。
　　雖然很多

3、研究表明Arf6和多種腫瘤的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)，但是目前尚未有報(bào)導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為與Arf6之間關(guān)系的研究。Arf6是否能夠調(diào)節(jié)前列腺癌細(xì)胞株增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移及可能的作用機(jī)制，目前尚不清楚。
　　目的：
　　本研究利用RNA干擾技術(shù)，下調(diào)Arf6表達(dá)，觀察Arf6對人雄激素非依賴性前列腺癌PC-3細(xì)胞株增殖、遷移和侵襲能力的影響，并初步探討其相關(guān)分子作用機(jī)制。
　　方法：
　　1、Arf6 siRNA序

4、列設(shè)計(jì)和干擾效果檢測:
　　根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中Arf6基因序列（GenBank: NM_001663.3），由廣州銳博生物設(shè)計(jì)合成3條針對不同靶向區(qū)域的Arf6特異性siRNA(smallinterference RNA)序列，siRNA干擾序列分別為:siRNA-1(792-810)，5'-GGGACGCCAUAAUCCUCAUdTdT-3'(sense),5'-AUGAGGAUUAUGGCGUCCCdTdT-3'(antis

5、ense);siRNA-2(534-552),5'-CAACAAUCCUGUACAAGUUdTdT-3'(sense),5'-AACUUGUACAGGAUUGUUGdTdT-3'(antisense), and siRNA-3(950-968),5'-CUCACAUGGUUAACCUCUAdTdT-3'(sense),5'-UAGAGGUUAACCAUGUGAGdTdT-3'(anti-sense)。取對數(shù)生長期前列腺癌PC-3細(xì)胞株，

6、細(xì)胞生長融合度達(dá)60-70％時(shí)，采用Lipofectamin(@)2000將上述siRNA轉(zhuǎn)入前列腺癌PC-3細(xì)胞株內(nèi)，并通過RealTime-PCR和蛋白質(zhì)印跡(western blot)法分別檢測3條不同siRNA對PC-3細(xì)胞Arf6 mRNA和蛋白干擾效率，篩選出干擾效果最佳的siRNA序列;最后，采用同樣的方法確定該siRNA序列的最適作用濃度和作用時(shí)間。
　　2、MTT法檢測細(xì)胞增殖:
　　將細(xì)胞分為三組:siR

7、NA-3組、陰性對照組(NC)和正常對照組(Con)，采用噻唑鹽(MTT)法分別檢測siRNA-3轉(zhuǎn)染48、72和96小時(shí)后，各組PC-3細(xì)胞OD490 nm吸光度值，繪制生長曲線，并計(jì)算siRNA-3組細(xì)胞抑制率。細(xì)胞存活率(％)=[OD(實(shí)驗(yàn)組)-OD(空白組)/OD(對照組)-OD（空白組）]×100％;細(xì)胞抑制率(％)=1-細(xì)胞存活率(％)。
　　3、劃痕愈合實(shí)驗(yàn):
　　取對數(shù)生長期的PC-3細(xì)胞接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板

8、，轉(zhuǎn)染siRNA48小時(shí)形成單層細(xì)胞后，進(jìn)行劃痕愈合實(shí)驗(yàn)，用含1％ FBS的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。分別于劃痕后0h、6h、12h和18h進(jìn)行拍照，每孔隨機(jī)選取5個(gè)視野，觀察細(xì)胞遷移距離和劃痕愈合率。細(xì)胞遷移距離=（劃痕寬度0h-劃痕寬度xh）/2;劃痕愈合率=[（劃痕區(qū)域面積0h-劃痕區(qū)域面積xh）/劃痕區(qū)域面積0h]×100％。
　　4、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn):
　　采用未包被和包被Matrigel基質(zhì)膠的Transwell

9、小室檢測單個(gè)PC-3細(xì)胞遷移和侵襲能力。Transwell小室內(nèi)分別培養(yǎng)24和48小時(shí)后，取出小室4％多聚甲醛固定15分鐘，1％結(jié)晶紫染色10分鐘，PBS清洗風(fēng)干后，顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)(100×)。
　　5、Arf6信號通路相關(guān)蛋白的檢測:
　　為了進(jìn)一步探討siRNA-3干擾Arf6抑制前列腺癌細(xì)胞株增殖、遷移和侵襲可能的分子機(jī)制。我們采用蛋白質(zhì)印跡法檢測了Arf6調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長和侵襲相關(guān)的PI3K/A

10、KT和ERK/Rac1信號通路中關(guān)鍵信號分子AKT、p-AKT、ERK1/2、p-ERK1/2和Rac1在各組PC-3細(xì)胞中的表達(dá)情況。
　　6、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:
　　各獨(dú)立實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，兩兩比較用t檢驗(yàn)，各組間的比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1、siRNA-3抑制前列腺癌PC-3細(xì)胞內(nèi)源性ArfmRNA和蛋白

11、的表達(dá)。
　　與空白對照組相比，轉(zhuǎn)染陰性對照序列對PC-3細(xì)胞內(nèi)源性Arf6的RNA和蛋白表達(dá)無明顯影響(P＞0.05)。3條特異性Arf6 siRNA靶向序列(siRNA-1，siRNA-2和siRNA-3)均不同程度的抑制了PC-3細(xì)胞Arf6 RNA和蛋白的表達(dá)，其RNA抑制率分別為(34.82±4.79)％、(56.85±1.52)％和(91.88±3.13)％，蛋白抑制率分別為(25.73±1.25)％、(67.11±1

12、.08)％和(86.37±0.57)％。其中siRNA-3對前列腺癌PC-3細(xì)胞內(nèi)源性Arf6干擾效果最好(P＜0.05)。轉(zhuǎn)染不同濃度的siRNA-3（10 nmol/L、20 nmol/L和50 nmol/L）至PC-3細(xì)胞內(nèi)，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，采用上述方法檢測不同濃度siRNA-3的干擾效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)siRNA-3(50nmol/L)能顯著抑制PC-3細(xì)胞內(nèi)源性Arf6的表達(dá)(P＜0.05)，并且這種抑制效應(yīng)能夠持續(xù)到細(xì)胞轉(zhuǎn)染后96

13、小時(shí)，表明siRNA-3對PC-3細(xì)胞內(nèi)源性Arf6的抑制效應(yīng)呈劑量和時(shí)間依賴性。
　　2、siRNA-3干擾Arf6表達(dá)抑制前列腺癌PC-3細(xì)胞增殖。
　　利用噻唑鹽(MTT)法分別檢測siRNA-3、NC和Con組PC-3細(xì)胞siRNA轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)（48、72、96小時(shí)）的OD490 nm值，繪制細(xì)胞生長曲線，計(jì)算siRNA-3組細(xì)胞抑制率。siRNA-3轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)（48、72、96小時(shí)）對PC-3細(xì)胞抑制率分

14、別為（10.68±0.04）％，（16.51±0.04）％和(26.35±0.03)％，與對照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。siRNA-3對PC-3細(xì)胞增殖的抑制在轉(zhuǎn)染96小時(shí)后最為顯著，并具有時(shí)間依賴性。
　　3、siRNA-3干擾Arf6表達(dá)抑制PC-3細(xì)胞的遷移和侵襲能力。
　?、賱澓蹖?shí)驗(yàn)檢測siRNA-3干擾Arf6表達(dá)對PC-3細(xì)胞遷移能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)劃痕18小時(shí)后，Con和NC組PC-3細(xì)胞遷移距離和

15、劃痕愈合率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，而siRNA-3組細(xì)胞遷移距離較對照組明顯減少(P＜0.001)，而劃痕愈合率僅為對照組的45-50％(P＜0.05)。
　?、赥ranswell體外遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示siRNA-3組穿過transwell小室的細(xì)胞數(shù)較對照組減少了61.61％(P＜0.05)，而正常對照和陰性對照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。Matrigel基質(zhì)膠包被的transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:s

16、iRNA-3組穿過Transwell小室膜的細(xì)胞數(shù)較對照組減少了89.44％(P＜0.05)，而正常對照組和陰性對照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。表明siRNA-3干擾PC-3細(xì)胞內(nèi)源性Arf6表達(dá)能夠有效抑制細(xì)胞體外遷移和侵襲能力。
　　4、siRNA-3干擾Arf6表達(dá)抑制p-ERK1/2和Rac1表達(dá)。
　　蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果顯示siRNA-3下調(diào)Arf6表達(dá)后，PC-3細(xì)胞內(nèi)p-ERK1/2和Rac1蛋白表

17、達(dá)水平較對照組明顯降低，而AKT、p-AKT和ERK1/2蛋白表達(dá)水平較對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明siRNA-3下調(diào)Arf6表達(dá)抑制PC-3細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力可能與p-ERK和Rac1表達(dá)下調(diào)相關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1、特異性siRNA-3能夠顯著抑制人雄激素非依賴性前列腺癌PC-3細(xì)胞內(nèi)源性Arf6的mRNA和蛋白表達(dá)。
　　2、Arf6表達(dá)下調(diào)后，前列腺癌PC-3細(xì)胞體外增殖、遷移和侵襲能力受到抑制。