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文檔簡介
1、本實(shí)驗(yàn)共分為四個(gè)部分: 第一部分:三氧化二砷對(duì)前列腺癌PC-3細(xì)胞系細(xì)胞周期及端粒酶活性的影響我們應(yīng)用體外細(xì)胞生長抑制試驗(yàn)(MTT比色法)研究對(duì)PC-3細(xì)胞生長的影響;流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布情況及凋亡情況;TRAP-ELASA方法檢測藥物作用前后端粒酶的活性。MTT結(jié)果發(fā)現(xiàn),6μmol/l As2O3對(duì)PC-3細(xì)胞即具有抑制作用,隨著濃度的增加和作用時(shí)間的延長,抑制作用進(jìn)一步增強(qiáng),作用48小時(shí),IC50為16.21μmol/
2、L。18μmol/L的As2O3與PC-3細(xì)胞共培養(yǎng)48h后,電鏡下部分癌細(xì)胞出現(xiàn)凋亡形態(tài)學(xué)改變,經(jīng)6μmol/L、12μmol/L、18μmol/L、24μmol/L的As2O3作用48h后,細(xì)胞凋亡率逐漸增加,在流式圖上可見到代表凋亡的亞G1峰,且24μmol/L組、18μmol/L組、12μmol/L組的As2O3組細(xì)胞凋亡率明顯高于6μmol/L組(P<0.05)。四組濃度處理后的PC-3細(xì)胞凋亡率分別為4.8%,15.2%,1
3、9.6%,29.7%,同正常組比較有顯著性差異(P<0.01),G0/G1期細(xì)胞比例明顯增加,而S期和G2/M期細(xì)胞明顯減少。PC-3細(xì)胞端粒酶活性隨著作用時(shí)間及作用濃度的增加而降低,具有時(shí)間劑量效應(yīng)關(guān)系,但當(dāng)濃度增加至18μmol/L以上時(shí),隨著濃度的增加,對(duì)端粒酶活性的抑制無顯著性差異(P>0.05)。 第二部分:三氧化二砷對(duì)前列腺癌DU-145細(xì)胞周期阻滯及凋亡的影響DU-145也是非雄依賴的前列腺癌細(xì)胞系,研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),
4、As2O3對(duì)DU-145細(xì)胞生長具有抑制作用,2μmol/L的As2O3作用24h即對(duì)DU-145細(xì)胞具有抑制作用,當(dāng)濃度增加至6μmol/L以上時(shí),抑制作用更為明顯,作用48小時(shí),IC50為8.02μmol/L,作用72小時(shí)IC50為6.21μmol/L;電鏡觀察DU-145細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn):8.0μmol/L的As2O3與DU-145細(xì)胞共培養(yǎng)48h后,部分癌細(xì)胞出現(xiàn)凋亡形態(tài)學(xué)改變,晚期可產(chǎn)生凋亡小體。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周
5、期的分布發(fā)現(xiàn)經(jīng)6、8、10μmol/L的As2O3作用48h后,DU-145細(xì)胞凋亡率明顯增加,與空白對(duì)照組比較有顯著性差異(P<0.01),G0/G1期細(xì)胞比例明顯下降,而G2/M期細(xì)胞比例明顯增加,和對(duì)照組相比有顯著性差異(P<0.01),在48小時(shí)2μmol/LAs2O3作用組未見代表細(xì)胞凋亡的亞G1峰,而在8μmol/L作用組,在正常二倍體峰前面可看到一個(gè)明顯的代表凋亡的亞G1峰;As2O3處理DU-145細(xì)胞基因組DNA電泳結(jié)
6、果發(fā)現(xiàn):不同濃度的As2O3處理DU-145細(xì)胞48h后,基因組DNA凝膠電泳呈現(xiàn)明顯的梯狀圖譜,這是核小體間DNA成180-200bp整倍斷裂的結(jié)果。 第三部分:Cyclopamine對(duì)非雄依賴的前列腺癌PC-3細(xì)胞的影響通過MTT檢測Cyclopamine對(duì)細(xì)胞生長增殖的影響,BrdU摻入檢測PC-3細(xì)胞DNA合成的情況,流式檢測Cyclopamine對(duì)PC-3細(xì)胞周期的影響,TRAP-ELISA法細(xì)胞檢測端粒酶的活性。實(shí)驗(yàn)
7、結(jié)果顯示:Cyclopamine可以通過抑制Hh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而明顯抑制PC-3細(xì)胞的增殖,在4-8μmol/L有明顯的抑制作用;BrdU摻入結(jié)果PC-3細(xì)胞未加Cyclopamine時(shí)BrdU摻入陽性細(xì)胞平均約占細(xì)胞總數(shù)的79%±5.6,加入2μmol/L的Cyclopamine作用48小時(shí)后PC-3細(xì)胞BrdU摻入陽性細(xì)胞平均約占細(xì)胞總數(shù)的49%±8.3,低于對(duì)照組79%±5.6(P<0.05),加入4 μmol/L的Cyclopam
8、ine作用48小時(shí)后PC-3細(xì)胞BrdU摻入陽性細(xì)胞平均約占細(xì)胞總數(shù)的30%±6.8,明顯低于對(duì)照組(P<0.01),但加入Tomatidine(Cyclopamine類似物)作用48小時(shí)后BrdU摻入陽性細(xì)胞平均約占細(xì)胞總數(shù)的72%±6.9,與對(duì)照組相比差異無顯著性(P>0.05);流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期的結(jié)果為:4μmol/L的Cyclopamine作用48h后,PC-3細(xì)胞進(jìn)入S期比例由空白對(duì)照組的34.8%±1.13下降為13.
9、7%±0.18,G1期的細(xì)胞比例由空白對(duì)照組的46.8%±1.32下降為34.8%±0.78,G2期的細(xì)胞比例由空白對(duì)照組的19.7%±0.49上升為52.4%±0.56,Cyclopamine處理組在流式圖上還出現(xiàn)了明顯的凋亡峰;Cyclopamine對(duì)PC-3細(xì)胞端粒酶活性在低濃度和高濃度時(shí)均無明顯抑制作用,并且隨著作用時(shí)間的延長,亦無抑制作用。 第四部分:低劑量砷劑聯(lián)合Cyclopamine對(duì)前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3生長影響
10、的研究通過MTT檢測不同濃度砷劑聯(lián)合Cyclopamine對(duì)PC-3細(xì)胞生長的影響,電鏡觀察低劑量砷劑(6μmol/L)和Cyclopamine(2μmol/L)對(duì)PC-3細(xì)胞形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)的影響,以流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡,TRAP-ELISA檢測端粒酶活性,BrdU摻入方法檢測低劑量砷劑和Cyclopamine對(duì)PC-3細(xì)胞DNA合成的影響, RT-PCR法檢測GLI1的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:低劑量砷劑聯(lián)合Cyclopamine可以明顯
11、抑制PC-3細(xì)胞的增殖,作用48h可見細(xì)胞凋亡;流式細(xì)胞圖發(fā)現(xiàn)經(jīng)6μmol/L的As2O3和2μmol/L的Cyclopamine共同作用48h后,在流式圖上可見到代表凋亡的亞G1峰,聯(lián)合用藥組的細(xì)胞凋亡率明顯高于6μmol/L的As2O3組和2μmol/L的Cyclopamine組(P<0.01),其凋亡率與高濃度As2O3組(18μmol/L)的凋亡率無顯著性差別(P>0.05),高于4μmol/L的Cyclopamine組(P<0
12、.05):PC-3細(xì)胞對(duì)照組BrdU摻入陽性細(xì)胞平均約占細(xì)胞總數(shù)的79%+2.33,低劑量砷劑和Cyclopamine聯(lián)合用藥組作用PC-3細(xì)胞48h后,BrdU摻入陽性細(xì)胞數(shù)平均約占細(xì)胞總數(shù)的26%+3.82,與單藥作用組分別作用有顯著性差異(P<0.01),與4μmol/L的Cyclopamine作用組及18μmol/L的As2O3作用組相比則無顯著性差異(P>0.05);6μmol/L的AS2O3作用PC-3細(xì)胞48h后可以抑制端
13、粒酶的活性,吸光度A值為0.792±0.0 11,而聯(lián)合用藥組作用PC-3細(xì)胞48h后亦可抑制端粒酶的活性,吸光度A值為0.769±0.045.兩組之間無顯著性差異(P>0.05);但與對(duì)照組相比(A值為0.892±0.021)均有顯著性差異(P<0.05):RT-PCR結(jié)果顯示,在DNALadder約292bp處出現(xiàn)明暗相間的分子條帶,即為目的基因GLI1;而在約579 bp處出現(xiàn)粗細(xì)、明暗均較均一的條帶,此即內(nèi)參GAPDH,說明PC
14、-3細(xì)胞GLI1的表達(dá)較強(qiáng),與2μmol/L的Cyclopamine共同作用48h后,GLI1的表達(dá)有所減弱,隨著其濃度的增加,在4μmol/L組GLI1的表達(dá)進(jìn)一步減弱,與對(duì)照組相比均有顯著性差異(P<0.05);而聯(lián)合用藥組盡管對(duì)GLI1的表達(dá)也有抑制,與對(duì)照組相比有顯著性差異(P<0.05),但與2μmol/L的Cyclopamine單獨(dú)用藥組相比,抑制作用無增強(qiáng)或減弱,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析無顯著性差異(P>0.05),進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),無
15、論是低劑量砷劑還是高劑量砷劑,其對(duì)GLI1的表達(dá)均無影響。 結(jié)論: 一.As2O3可明顯抑制前列腺癌非雄依賴的PC-3細(xì)胞的增殖,其途徑可能與以下兩方面機(jī)制有關(guān),一是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,抑制細(xì)胞周期,二是下調(diào)細(xì)胞的端粒酶活性,但對(duì)Hh信號(hào)通路的關(guān)鍵因子GLI1的活性無影響。 二.As203對(duì)前列腺癌非雄依賴的DU-145細(xì)胞系也有明顯的抑制作用,且隨著藥物濃度增加和作用時(shí)間延長,凋亡細(xì)胞明顯增加,出現(xiàn)G2/M期阻滯和D
16、NA的斷裂。 三.Cyclopamine可以通過抑制Hh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而明顯抑制PC-3細(xì)胞的增殖和DNA的合成,降低GLI1的表達(dá),抑制細(xì)胞的周期,誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡,但對(duì)細(xì)胞端粒酶活性無抑制作用。 四.低劑量砷劑(6μmol/L)和Cyclopamine(2μmol/L)的聯(lián)合應(yīng)用可以抑制PC-3細(xì)胞的增殖,并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,細(xì)胞凋亡率明顯高于6μmol/L的As203組和2μmol/L的Cyclopamine組,與高濃度A
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