低劑量砷劑聯合Cyclopamine對前列腺癌細胞株PC-3生長影響機制的初步研究.pdf

1、本實驗共分為四個部分： 第一部分：三氧化二砷對前列腺癌PC-3細胞系細胞周期及端粒酶活性的影響我們應用體外細胞生長抑制試驗(MTT比色法)研究對PC-3細胞生長的影響；流式細胞儀檢測細胞周期分布情況及凋亡情況；TRAP-ELASA方法檢測藥物作用前后端粒酶的活性。MTT結果發(fā)現，6μmol/l As2O3對PC-3細胞即具有抑制作用，隨著濃度的增加和作用時間的延長，抑制作用進一步增強，作用48小時，IC50為16.21μmol/

2、L。18μmol/L的As2O3與PC-3細胞共培養(yǎng)48h后，電鏡下部分癌細胞出現凋亡形態(tài)學改變，經6μmol/L、12μmol/L、18μmol/L、24μmol/L的As2O3作用48h后，細胞凋亡率逐漸增加，在流式圖上可見到代表凋亡的亞G1峰，且24μmol/L組、18μmol/L組、12μmol/L組的As2O3組細胞凋亡率明顯高于6μmol/L組(P<0.05)。四組濃度處理后的PC-3細胞凋亡率分別為4.8％，15.2％，1

3、9.6％，29.7％，同正常組比較有顯著性差異(P<0.01)，G0/G1期細胞比例明顯增加，而S期和G2/M期細胞明顯減少。PC-3細胞端粒酶活性隨著作用時間及作用濃度的增加而降低，具有時間劑量效應關系，但當濃度增加至18μmol/L以上時，隨著濃度的增加，對端粒酶活性的抑制無顯著性差異(P>0.05)。 第二部分：三氧化二砷對前列腺癌DU-145細胞周期阻滯及凋亡的影響DU-145也是非雄依賴的前列腺癌細胞系，研究結果發(fā)現，

4、As2O3對DU-145細胞生長具有抑制作用，2μmol/L的As2O3作用24h即對DU-145細胞具有抑制作用，當濃度增加至6μmol/L以上時，抑制作用更為明顯，作用48小時，IC50為8.02μmol/L，作用72小時IC50為6.21μmol/L；電鏡觀察DU-145細胞超微結構發(fā)現：8.0μmol/L的As2O3與DU-145細胞共培養(yǎng)48h后，部分癌細胞出現凋亡形態(tài)學改變，晚期可產生凋亡小體。流式細胞儀檢測細胞凋亡及細胞周

5、期的分布發(fā)現經6、8、10μmol/L的As2O3作用48h后，DU-145細胞凋亡率明顯增加，與空白對照組比較有顯著性差異(P<0.01)，G0/G1期細胞比例明顯下降，而G2／M期細胞比例明顯增加，和對照組相比有顯著性差異(P<0.01)，在48小時2μmol/LAs2O3作用組未見代表細胞凋亡的亞G1峰，而在8μmol/L作用組，在正常二倍體峰前面可看到一個明顯的代表凋亡的亞G1峰；As2O3處理DU-145細胞基因組DNA電泳結

6、果發(fā)現：不同濃度的As2O3處理DU-145細胞48h后，基因組DNA凝膠電泳呈現明顯的梯狀圖譜，這是核小體間DNA成180-200bp整倍斷裂的結果。 第三部分：Cyclopamine對非雄依賴的前列腺癌PC-3細胞的影響通過MTT檢測Cyclopamine對細胞生長增殖的影響，BrdU摻入檢測PC-3細胞DNA合成的情況，流式檢測Cyclopamine對PC-3細胞周期的影響，TRAP-ELISA法細胞檢測端粒酶的活性。實驗

7、結果顯示：Cyclopamine可以通過抑制Hh信號轉導通路而明顯抑制PC-3細胞的增殖，在4-8μmol/L有明顯的抑制作用；BrdU摻入結果PC-3細胞未加Cyclopamine時BrdU摻入陽性細胞平均約占細胞總數的79％±5．6，加入2μmol/L的Cyclopamine作用48小時后PC-3細胞BrdU摻入陽性細胞平均約占細胞總數的49％±8.3，低于對照組79％±5.6(P<0.05)，加入4 μmol/L的Cyclopam

8、ine作用48小時后PC-3細胞BrdU摻入陽性細胞平均約占細胞總數的30％±6.8，明顯低于對照組(P<0.01)，但加入Tomatidine(Cyclopamine類似物)作用48小時后BrdU摻入陽性細胞平均約占細胞總數的72％±6.9，與對照組相比差異無顯著性(P>0.05)；流式細胞儀檢測細胞周期的結果為：4μmol/L的Cyclopamine作用48h后，PC-3細胞進入S期比例由空白對照組的34.8％±1.13下降為13.

9、7％±0.18，G1期的細胞比例由空白對照組的46.8％±1.32下降為34.8％±0.78，G2期的細胞比例由空白對照組的19.7％±0.49上升為52.4％±0.56，Cyclopamine處理組在流式圖上還出現了明顯的凋亡峰；Cyclopamine對PC-3細胞端粒酶活性在低濃度和高濃度時均無明顯抑制作用，并且隨著作用時間的延長，亦無抑制作用。 第四部分：低劑量砷劑聯合Cyclopamine對前列腺癌細胞株PC-3生長影響

10、的研究通過MTT檢測不同濃度砷劑聯合Cyclopamine對PC-3細胞生長的影響，電鏡觀察低劑量砷劑(6μmol/L)和Cyclopamine(2μmol/L)對PC-3細胞形態(tài)和超微結構的影響，以流式細胞儀檢測細胞凋亡，TRAP-ELISA檢測端粒酶活性，BrdU摻入方法檢測低劑量砷劑和Cyclopamine對PC-3細胞DNA合成的影響， RT-PCR法檢測GLI1的表達。實驗結果顯示：低劑量砷劑聯合Cyclopamine可以明顯

11、抑制PC-3細胞的增殖，作用48h可見細胞凋亡；流式細胞圖發(fā)現經6μmol/L的As2O3和2μmol/L的Cyclopamine共同作用48h后，在流式圖上可見到代表凋亡的亞G1峰，聯合用藥組的細胞凋亡率明顯高于6μmol/L的As2O3組和2μmol/L的Cyclopamine組(P<0.01)，其凋亡率與高濃度As2O3組(18μmol/L)的凋亡率無顯著性差別(P>0.05)，高于4μmol/L的Cyclopamine組(P<0

12、.05)：PC-3細胞對照組BrdU摻入陽性細胞平均約占細胞總數的79％+2.33，低劑量砷劑和Cyclopamine聯合用藥組作用PC-3細胞48h后，BrdU摻入陽性細胞數平均約占細胞總數的26％+3.82，與單藥作用組分別作用有顯著性差異(P<0.01)，與4μmol/L的Cyclopamine作用組及18μmol/L的As2O3作用組相比則無顯著性差異(P>0．05)；6μmol/L的AS2O3作用PC-3細胞48h后可以抑制端

13、粒酶的活性，吸光度A值為0．792±0．0 11，而聯合用藥組作用PC-3細胞48h后亦可抑制端粒酶的活性，吸光度A值為0．769±0．045．兩組之間無顯著性差異(P>0．05)；但與對照組相比(A值為0．892±0．021)均有顯著性差異(P<0．05)：RT-PCR結果顯示，在DNALadder約292bp處出現明暗相間的分子條帶，即為目的基因GLI1；而在約579 bp處出現粗細、明暗均較均一的條帶，此即內參GAPDH，說明PC

14、-3細胞GLI1的表達較強，與2μmol/L的Cyclopamine共同作用48h后，GLI1的表達有所減弱，隨著其濃度的增加，在4μmol/L組GLI1的表達進一步減弱，與對照組相比均有顯著性差異(P<0．05)；而聯合用藥組盡管對GLI1的表達也有抑制，與對照組相比有顯著性差異(P<0．05)，但與2μmol/L的Cyclopamine單獨用藥組相比，抑制作用無增強或減弱，統計學分析無顯著性差異(P>0．05)，進一步的研究發(fā)現，無

15、論是低劑量砷劑還是高劑量砷劑，其對GLI1的表達均無影響。 結論： 一．As2O3可明顯抑制前列腺癌非雄依賴的PC-3細胞的增殖，其途徑可能與以下兩方面機制有關，一是誘導細胞凋亡，抑制細胞周期，二是下調細胞的端粒酶活性，但對Hh信號通路的關鍵因子GLI1的活性無影響。 二．As203對前列腺癌非雄依賴的DU-145細胞系也有明顯的抑制作用，且隨著藥物濃度增加和作用時間延長，凋亡細胞明顯增加，出現G2/M期阻滯和D

16、NA的斷裂。 三．Cyclopamine可以通過抑制Hh信號轉導通路而明顯抑制PC-3細胞的增殖和DNA的合成，降低GLI1的表達，抑制細胞的周期，誘導細胞的凋亡，但對細胞端粒酶活性無抑制作用。 四．低劑量砷劑(6μmol/L)和Cyclopamine(2μmol/L)的聯合應用可以抑制PC-3細胞的增殖，并誘導細胞凋亡，細胞凋亡率明顯高于6μmol/L的As203組和2μmol/L的Cyclopamine組，與高濃度A