神經(jīng)肽酪氨酸（NPY）調(diào)節(jié)肝臟再生的實驗研究.pdf

1、肝衰竭、肝硬化和原發(fā)性肝癌等終末期肝病嚴(yán)重威脅人類的健康。我國每年因原發(fā)性肝癌死亡人數(shù)達20萬；1990年美國因肝衰竭死亡達27，000人；據(jù)55個國家向WHO提供的數(shù)字，每年全世界死于肝硬化的人數(shù)超出31萬，近幾年來已增加到50萬。目前已有的治療手段當(dāng)中，只有肝臟移植能徹底治療終末期肝病。但是肝臟移植后供體肝的再生能力低下嚴(yán)重限制了肝臟移植的治療效果和大規(guī)模臨床應(yīng)用。其主要原因在于對肝臟再生的機制的研究仍然處于初級階段，對肝臟再生的機

2、制了解不夠詳細。目前的研究認(rèn)為肝臟再生受到多種基因和信號通路的調(diào)控。對肝臟再生的機制研究其目的是能夠找到促進肝臟再生的藥物，以提高肝臟移植后病人的存活率。 肝臟內(nèi)有大量自主神經(jīng)分布，近來自主神經(jīng)在肝臟再生過程中作用日益引起人們的關(guān)注。研究資料顯示交感神經(jīng)和迷走神經(jīng)都參與肝臟部分切除后的再生過程。最新的研究還發(fā)現(xiàn)神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺在肝臟再生過程中起著重要作用。文獻顯示在豚鼠、狗、豬、猴及人的肝實質(zhì)中也有NPY陽性自主神經(jīng)，且在肝

3、細胞周圍交織成網(wǎng)狀。應(yīng)用全基因組表達芯片，我們對小鼠肝臟四氯化碳損傷后再生過程中全基因組表達作了系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)肽酪氨酸(NPY)的基因表達與肝臟損傷后再生相關(guān)。目前還未見NPY調(diào)節(jié)肝臟再生過程的研究報道。本課題擬制備小鼠NPY(mNPY)的真核表達質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)染小鼠大腿肌肉的方式來初步檢測NPY對肝臟功能和肝細胞增殖的影響；然后再通過給小鼠注射蛋白的方式進一步確認(rèn)初步的實驗結(jié)果；最后再利用NPY多克隆抗體阻斷四氯化碳損傷后的小鼠肝臟

4、再生過程最終確定NPY的作用。本課題的研究結(jié)果有望為找到促進肝臟移植后供體肝的再生藥物的研究提供新的線索。 本課題從基因克隆開始，構(gòu)建了mNPY的真核表達質(zhì)粒。再將構(gòu)建好的mNPY真核表達質(zhì)粒電轉(zhuǎn)染到小鼠大腿肌肉細胞內(nèi)提高小鼠血漿內(nèi)的NPY濃度，再檢測肝臟功能和增殖的相關(guān)指標(biāo)。然后，人工合成NPY多肽并注射小鼠進一步重復(fù)mNPY真核質(zhì)粒電轉(zhuǎn)染實驗結(jié)果。最后構(gòu)建mNPY原核表達載體，在大腸桿菌中表達mNPY融合蛋白，經(jīng)過純化后免

5、疫大白兔獲得mNPY兔多克隆抗體，再利用獲得的多克隆抗體阻斷小鼠四氯化碳后肝臟損傷再生過程。 本研究的主要結(jié)果和結(jié)論如下：利用PCR方法成功從小鼠肝臟cDNA文庫中克隆得到mNPY成熟肽的基因片斷，瓊脂糖凝膠電泳驗證約300bp大??；成功將mNPY成熟肽克隆到pcDNA、PET-28和PET-30載體上，并且測序結(jié)果正確；成功表達mNPY融合蛋白并制備了mNPY融合蛋白兔多克隆抗體，且Westernblot檢測抗體效價較高;m