神經(jīng)肽酪氨酸（NPY）調(diào)節(jié)肝臟再生的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、肝衰竭、肝硬化和原發(fā)性肝癌等終末期肝病嚴(yán)重威脅人類的健康。我國每年因原發(fā)性肝癌死亡人數(shù)達(dá)20萬；1990年美國因肝衰竭死亡達(dá)27，000人；據(jù)55個(gè)國家向WHO提供的數(shù)字，每年全世界死于肝硬化的人數(shù)超出31萬，近幾年來已增加到50萬。目前已有的治療手段當(dāng)中，只有肝臟移植能徹底治療終末期肝病。但是肝臟移植后供體肝的再生能力低下嚴(yán)重限制了肝臟移植的治療效果和大規(guī)模臨床應(yīng)用。其主要原因在于對(duì)肝臟再生的機(jī)制的研究仍然處于初級(jí)階段，對(duì)肝臟再生的機(jī)

2、制了解不夠詳細(xì)。目前的研究認(rèn)為肝臟再生受到多種基因和信號(hào)通路的調(diào)控。對(duì)肝臟再生的機(jī)制研究其目的是能夠找到促進(jìn)肝臟再生的藥物，以提高肝臟移植后病人的存活率。 肝臟內(nèi)有大量自主神經(jīng)分布，近來自主神經(jīng)在肝臟再生過程中作用日益引起人們的關(guān)注。研究資料顯示交感神經(jīng)和迷走神經(jīng)都參與肝臟部分切除后的再生過程。最新的研究還發(fā)現(xiàn)神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺在肝臟再生過程中起著重要作用。文獻(xiàn)顯示在豚鼠、狗、豬、猴及人的肝實(shí)質(zhì)中也有NPY陽性自主神經(jīng)，且在肝

3、細(xì)胞周圍交織成網(wǎng)狀。應(yīng)用全基因組表達(dá)芯片，我們對(duì)小鼠肝臟四氯化碳損傷后再生過程中全基因組表達(dá)作了系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)肽酪氨酸(NPY)的基因表達(dá)與肝臟損傷后再生相關(guān)。目前還未見NPY調(diào)節(jié)肝臟再生過程的研究報(bào)道。本課題擬制備小鼠NPY(mNPY)的真核表達(dá)質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)染小鼠大腿肌肉的方式來初步檢測(cè)NPY對(duì)肝臟功能和肝細(xì)胞增殖的影響；然后再通過給小鼠注射蛋白的方式進(jìn)一步確認(rèn)初步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；最后再利用NPY多克隆抗體阻斷四氯化碳損傷后的小鼠肝臟

4、再生過程最終確定NPY的作用。本課題的研究結(jié)果有望為找到促進(jìn)肝臟移植后供體肝的再生藥物的研究提供新的線索。 本課題從基因克隆開始，構(gòu)建了mNPY的真核表達(dá)質(zhì)粒。再將構(gòu)建好的mNPY真核表達(dá)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)染到小鼠大腿肌肉細(xì)胞內(nèi)提高小鼠血漿內(nèi)的NPY濃度，再檢測(cè)肝臟功能和增殖的相關(guān)指標(biāo)。然后，人工合成NPY多肽并注射小鼠進(jìn)一步重復(fù)mNPY真核質(zhì)粒電轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果。最后構(gòu)建mNPY原核表達(dá)載體，在大腸桿菌中表達(dá)mNPY融合蛋白，經(jīng)過純化后免

5、疫大白兔獲得mNPY兔多克隆抗體，再利用獲得的多克隆抗體阻斷小鼠四氯化碳后肝臟損傷再生過程。 本研究的主要結(jié)果和結(jié)論如下：利用PCR方法成功從小鼠肝臟cDNA文庫中克隆得到mNPY成熟肽的基因片斷，瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證約300bp大?。怀晒NPY成熟肽克隆到pcDNA、PET-28和PET-30載體上，并且測(cè)序結(jié)果正確；成功表達(dá)mNPY融合蛋白并制備了mNPY融合蛋白兔多克隆抗體，且Westernblot檢測(cè)抗體效價(jià)較高;m