神經(jīng)肽Substance P調(diào)控中性粒細(xì)胞影響角膜神經(jīng)再生的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：通過C57小鼠和B6.Cg-Tac1tm1Bbm/J(SP KO)小鼠角膜神經(jīng)再生模型，研究SP-NK1R信號(hào)通路介導(dǎo)角膜損傷神經(jīng)再生的關(guān)鍵作用及其分子機(jī)制。
　　方法：鼠尾基因鑒定法鑒定SP敲除小鼠;裂隙燈顯微鏡觀察SP敲除小鼠角膜表型;角膜神經(jīng)染色法檢測SP敲除小鼠角膜神經(jīng)分布。構(gòu)建小鼠角膜上皮損傷模型，角膜熒光素鈉染色法統(tǒng)計(jì)小鼠角膜上皮損傷修復(fù)速率;通過Real-time PCR(RT-PCR)檢測小鼠角膜上皮的神經(jīng)營

2、養(yǎng)因子的表達(dá)。建立小鼠角膜上皮損傷模型，實(shí)驗(yàn)分為正常對照組、正常小鼠+L733060組（結(jié)膜下注射）、SP敲除小鼠組、SP敲除小鼠+Sar-SP組（局部點(diǎn)眼）。通過角膜神經(jīng)染色檢測小鼠角膜基底膜再生神經(jīng)纖維密度;通過流式細(xì)胞儀分析角膜中中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞趨化的數(shù)量變化;通過RT-PCR檢測小鼠角膜損傷后神經(jīng)再生相關(guān)基因的表達(dá);通過免疫熒光共定位驗(yàn)證小鼠角膜中性粒細(xì)胞浸潤數(shù)量的變化;通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Elisa)檢測小鼠角膜中NGF

3、的表達(dá)水平的變化。檢測中性粒細(xì)胞清除及巨噬細(xì)胞清除后，小鼠角膜基底膜再生神經(jīng)纖維密度以及小鼠角膜上皮損傷修復(fù)速率。
　　結(jié)果：鼠尾基因鑒定結(jié)果驗(yàn)證Tac-1（SP基因）完全敲除。與對照組相比，SP敲除小鼠角膜正常，未出現(xiàn)自發(fā)病理特征，且SP敲除小鼠角膜基底膜神經(jīng)纖維和上皮末梢神經(jīng)纖維分布均無顯著變化(P＞0.05)。與正常C57小鼠相比，SP敲除小鼠的角膜上皮修復(fù)速率未見顯著變化(P＞0.05);而且SP敲除小鼠完整角膜上皮和再生

4、角膜上皮中神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)未見顯著變化(P＞0.05)。角膜神經(jīng)染色結(jié)果顯示，與正常小鼠相比，SP敲除小鼠角膜基底膜再生神經(jīng)密度顯著減少(P＜0.05)，而外源性補(bǔ)充Sar-SP可顯著恢復(fù)SP敲除小鼠角膜神經(jīng)再生(P＜0.05);正常小鼠結(jié)膜下注射L733060可顯著抑制角膜神經(jīng)再生(P＜0.05)。流式細(xì)胞儀分析結(jié)果與免疫熒光結(jié)果顯示:與對照組相比，SP敲除小鼠及L733060干預(yù)組小鼠角膜中性粒細(xì)胞(CD45+/CD11 b+/L

5、y6G+)的浸潤數(shù)量顯著減少(P＜0.05)，而Sar-SP可以顯著恢復(fù)中性粒細(xì)胞的浸潤，但巨噬細(xì)胞(CD45+/CD11 b+/F4/80+)浸潤數(shù)量未受影響(P＞0.05)。與正常對照組相比，中性粒細(xì)胞完全清除可以顯著抑制角膜神經(jīng)再生以及角膜上皮愈合(P＜0.05)，但巨噬細(xì)胞完全清除對其無顯著作用(P＞0.05)。與正常小鼠相比， SP敲除小鼠角膜中NGF表達(dá)明顯降低(P＜0.05)，而外源性給予Sar-SP可恢復(fù)NGF表達(dá)(P＜