人腫瘤抑素（tumstatin）及血管生成抑制因子VT-ChPr的克隆、表達(dá)和活性分析.pdf

1、人腫瘤抑素(tumstatin)及血管生成抑制因子VT-ChPr的克隆、表達(dá)和活性分析生物化學(xué)與分子生物學(xué)博士生：顧取良指導(dǎo)教師：羅進(jìn)賢教授人腫瘤抑素(humantumstatin，hTum)是Ⅳ型膠原蛋白α3鏈C端NC1區(qū)來源的28kD左右的片段，它能夠通過與整合素αvβ3結(jié)合而誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖，并顯示出明顯的抑制血管生成的作用，因而在腫瘤和其他血管異常增生性疾病的治療中有應(yīng)用潛力。 本文采用PCR技術(shù)從人

2、胎肺cDNA文庫中擴(kuò)增了腫瘤抑素cDNA序列。將該cDNA克隆至載體pET-3c，獲得的重組質(zhì)粒pET-3c-tum轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliBL21(DE3)。SDS-PAGE結(jié)果顯示，hTum在E.coliBL21(DE3，pET-3c-tum)中實(shí)現(xiàn)了非融合表達(dá)，將表達(dá)產(chǎn)物帶從SDS-PAGE膠中切下回收目的蛋白，免疫新西蘭大白兔獲得ELISA效價(jià)高達(dá)1：1000的特異性兔抗人腫瘤抑素抗血清。將人腫瘤抑素cDNA克隆至酵母表達(dá)載體p

3、PIC9k和pPICZαA，獲得的重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，構(gòu)建畢赤酵母表達(dá)菌株GS115(pPIC9k-tum)和GS115(pPICZα-tum)。經(jīng)SDS-PAGE和Westernblot分析，證明人腫瘤抑素(YhTum)獲得分泌表達(dá)，表達(dá)量約25mg/L。將GS115(pPICZα-tum)的表達(dá)上清用SP-Sepharose離子交換層析純化，產(chǎn)物純度達(dá)到85％，并能明顯抑制雞胚CAM血管生成。 將人腫瘤抑素

4、cDNA克隆至原核表達(dá)載體pET-15b，轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)，實(shí)現(xiàn)了高效融合表達(dá)。融合表達(dá)產(chǎn)物(rhTum)經(jīng)變性裂解和金屬螯合親和層析純化后進(jìn)行梯度透析法復(fù)性，得到了純度高于92％的產(chǎn)物。純化產(chǎn)物具有免疫反應(yīng)活性，能顯著抑制體外內(nèi)皮細(xì)胞增殖和體內(nèi)雞胚CAM新生血管形成和小鼠黑色素瘤的生長。 為尋找抗血管生成和抗腫瘤活性更強(qiáng)的新候選分子，設(shè)計(jì)人腫瘤抑素66-99aa片段的34肽和鈣網(wǎng)蛋白122-178aa片段的

5、57肽通過Gly-Ser-Gly連接為嵌合重組蛋白VT-ChPr。將VT-ChPr基因克隆至質(zhì)粒pET-15b，轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)。SDS-PAGE結(jié)果顯示，VT-ChPr蛋白在E.coliBL21(DE3，pET-VT)中獲得了高效表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)變性裂解和金屬螯合親和層析純化，用稀釋法復(fù)性，經(jīng)分析最后產(chǎn)物純度大于90％。純化產(chǎn)物能夠顯著抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖和雞胚CAM新生血管形成，對(duì)小鼠黑色素瘤生長的抑制率達(dá)86.9％，