人腫瘤抑素的克隆、表達及其生物活性實驗研究.pdf

1、腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移都依賴于新生血管的生成，如果能抑制新生血管的形成，腫瘤細(xì)胞將發(fā)生凋亡或壞死。目前，已有多種抑制新生血管生成的藥物用于抗腫瘤的研究。近來發(fā)現(xiàn)了一些分離于組織或體液的血管生成抑制物，它們是大分子蛋白的生物活性片斷。腫瘤抑素(tumstatin)是繼血管生成抑素(angiostatin)和內(nèi)皮抑素(endostatin)之后，最新發(fā)現(xiàn)的源于人基膜ColⅣ的腫瘤新生血管生成的抑制因子，分子量為28kDa，由244個氨基酸組成，包

2、括Col Ⅳα 3的NC1活性區(qū)域的232個氨基酸和中間3股螺旋區(qū)C-端的12個氨基酸。近來研究表明，Tumstatin有兩個不同的活性區(qū)，一個是N端的54～132氨基酸組成的78肽(tum-5)，其中74～98位氨基酸組成的T7肽可通過內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，使腫瘤新生血管合成受到抑制，從而抑制腫瘤生長、浸潤和轉(zhuǎn)移。另一個是靠近C端的185～203氨基酸組成的19肽，直接作用于腫瘤細(xì)胞，抑制其生長。這些作用主要是通過Tumstatin和腫瘤新生

3、血管上特異高表達的整合素α v β 3結(jié)合來實現(xiàn)的。整合素α v β 3是近來研究較多的一個腫瘤新生血管上較理想的靶位點，由于Tumstatin具有與其特異的結(jié)合能力，通過用<'131>I、<'99>Tc<'m>等放射性同位素標(biāo)記Tumstatin，進行腫瘤的放射受體顯像，具有重要和潛在的臨床應(yīng)用價值。 在本研究中，我們從HEK293細(xì)胞中提取總RNA，通過RT-PCR擴增出人Tumstatin基因，將該基因?qū)肟寺≥d體pMD1

4、9-T中，通過菌落PCR、質(zhì)粒限制性內(nèi)切酶鑒定和DNA序列分析，獲得重組質(zhì)粒pMD19-Tumstatin，然后亞克隆至表達載體pET28a(+)中，通過菌落PCR、酶切鑒定和序列分析，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET28a(+)-Tumstatin，然后將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達菌E．coli BL21(DE3)。分別對IPTG濃度、表達溫度、誘導(dǎo)時間和表達部位等表達條件進行了優(yōu)化，并通過SDS-PAGE和Western Blot來鑒定。對表達的包涵體，

5、通過Ni柱親和層析來進行純化。對洗脫下的目的蛋白進行透析復(fù)性，BCA法測定重組人Tumstatin蛋白濃度。并通過MTT實驗來驗證其抑制腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)活性。實驗結(jié)果表明，提取的RNA經(jīng)電泳，有明顯的28S和18S兩條帶，且兩者亮度約為2：1，表明RNA比較完整，通過紫外測其濃度，RNA的濃度為7.63μg/μl。PCR產(chǎn)物電泳顯示在750bp附近有目的條帶，表明目的基因得到了擴增。菌落PCR、酶切鑒定和序列分析等結(jié)果表明，成功的構(gòu)建了

6、含有人Tumstatin基因的表達載體pET28a(+)-Tumstatin。SDS-PAGE和Western Blot顯示在IPTG誘導(dǎo)下，重組人Tumstatin得到了表達，表達量約占菌體總蛋白的30％，主要以包涵體的形式存在。優(yōu)化的最佳表達條件為： IPTG終濃度為1 mM，誘導(dǎo)溫度為37℃，時間為5 hr。SDS-PAGE顯示，Ni柱親和層析時，當(dāng)洗脫的咪唑濃度為300mM時，目的蛋白被洗脫下來，得到了較純的蛋白。通過尿素梯度透