腫瘤抑素（tumstatin）和TRAIL融合蛋白的克隆、表達(dá)及生物學(xué)活性研究.pdf

1、腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移都依賴于新生血管的生成和重塑,腫瘤新生血管已成為嶄新的、有希望的抗腫瘤治療靶點(diǎn)。在生理狀態(tài)下血管生成促進(jìn)因子和抑制因子之間達(dá)到平衡,而腫瘤血管形成的分子機(jī)制涉及到兩者之間的調(diào)節(jié)失衡。因此,如果抑制腫瘤新生血管的形成和重塑,腫瘤細(xì)胞將發(fā)生凋亡或壞死,這為抗腫瘤治療開辟了新思路?；啄な羌?xì)胞外基質(zhì),提供上皮和內(nèi)皮細(xì)胞的生長支持結(jié)構(gòu),它的形成依賴于IV型膠原(Col IV)網(wǎng)絡(luò)的組裝。Col IV由6條不同的α鏈,即α1-6,

2、并以不同或相同的α鏈組成三聚體,進(jìn)一步形成網(wǎng)絡(luò)為其它大分子提供支架。其中的非膠原區(qū)(NC1)經(jīng)由不同作用機(jī)理展示出良好的抗血管活性,以ColIV α3鏈的NC1在抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡方面效應(yīng)最強(qiáng)。血管生成抑制劑tumsatin(腫瘤抑素)是ColIVα3的生物活性NC1區(qū)的一部分(28 kDa),由ColIVα3鏈的中間3股螺旋區(qū)域C-端12個(gè)aa和NC1的232 aa,共244 aa組成。在20世紀(jì)80年代,作為肺-腎出

3、血綜合癥的抗原被發(fā)現(xiàn)。2000年,Kamphaus研究表明,其C端185-203 aa具有抑制腫瘤細(xì)胞生長、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的直接抗腫瘤作用。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)屬于腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)超家族成員,為Ⅱ型跨膜蛋白,能選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,且對正常組織細(xì)胞沒有

4、明顯毒副作用。TRAIL全長由281個(gè)氨基酸組成,活性部位為114-281aa片段。我室研制的TRAIL重組蛋白臨床試驗(yàn)顯示出良好的抗腫瘤活性和低毒副作用。但是,有些腫瘤細(xì)胞對TRAIL不敏感甚至耐藥,因此,研制和開發(fā)活性更強(qiáng)、靶向性更明確的TRAIL類似物對于完全發(fā)揮TRAIL的抗腫瘤潛能和克服臨床耐藥具有重要的實(shí)際意義。 本研究將tumstatin183-230和TRAIL的活性片段進(jìn)行融合,希望得到具有雙功能作用的融合蛋白

5、,能夠特異性的殺傷腫瘤細(xì)胞并抑制新生血管的形成。課題內(nèi)容包括：①克隆、表達(dá)人的tumstatin 183-230和TRAIL活性片段并進(jìn)行生物學(xué)活性研究；②利用SOEing PCR技術(shù)擴(kuò)增tumstatin 183-230-TRAIL和TRAIL-tumstatin183-230的融合編碼序列,經(jīng)克隆表達(dá)純化后,鑒定雙功能蛋白及其生物學(xué)活性。 一、克隆、表達(dá)人的tumstatin183-230和TRAIL片段并進(jìn)行生物學(xué)活性研究

6、 利用PCR技術(shù)獲得tumstaitn 183-230和TRAIL基因片段,分別構(gòu)建pMAL-tumstatin183-230和pMAL-TRAIL的重組質(zhì)粒,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E.coli BL21(DE3),經(jīng)IPTG誘導(dǎo),融合蛋白得到了有效的表達(dá)。在E.coli BL21中的MBP-tumstatin183-230和MBP-TRAIL菌體占總蛋白含量為20％；超聲破菌后,融合蛋白主要在上清表達(dá),通過Amylose R

7、esin親和柱純化,獲得了MBP-tumstatin183-230和MBP-TRAIL蛋白,經(jīng)Werstern Blot鑒定在48 kDa和62 kDa處得到相應(yīng)的融合蛋白表達(dá)條帶。將純化的MBP-tumstatin183-230和MBP-TRAIL分別作用于內(nèi)皮細(xì)胞ECV304,人胰腺導(dǎo)管上皮癌細(xì)胞SW1990,人黑色素細(xì)胞瘤A375,和人肝癌細(xì)胞HepG2進(jìn)行活性分析。結(jié)果表明:MBP-tumstatin183-230對ECV304

8、,A375,HepG2的增殖抑制呈劑量依賴性。ED50分別為25μg/ml,20.42μg/ml,40.52μg/ml;但對SW1990并不敏感；TRAIL對各細(xì)胞的殺傷作用,計(jì)算細(xì)胞相對活力,結(jié)果表明：對SW1990,HepG2,A375均有明顯的殺傷作用。ED50分別為20 ng/ml,15 ng/ml,13 ng/ml。但對ECV304則在10μg/ml的濃度范圍內(nèi),并沒有顯示很強(qiáng)的殺傷作用。通過管狀結(jié)構(gòu)形成實(shí)驗(yàn),MBP-tums

9、tatin183-230可以明顯的抑制體外管狀結(jié)構(gòu)的形成,因此具有潛在的抗腫瘤活性。 二、融合蛋白tumsatin183-230和TRAIL克隆表達(dá),雙功能鑒定及其生物學(xué)活性研究 將tumsatin183-230和TRAIL的活性片段融合。希望得到的融合蛋白能夠靶向殺傷腫瘤細(xì)胞。我們選用原核表達(dá)系統(tǒng)制備該融合蛋白。首先,利用重疊PCR技術(shù),合成tumsatin183-23-TRAIL和TRAIL-tumstatin183

10、-230的雙向融合基因,tumsatin183-230和TRAIL之間通過氨基酸連接臂相連,將融合基因分別克隆到pMAL-c2載體中,獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pMAL-tumstatin183-230-TRAIL和pMAL-TRAIL-tumstatin183-230,將其轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)。在IPTG誘導(dǎo)下,SDS-PAGE分析表達(dá)量約占菌體總蛋白質(zhì)的20％左右,主要以可溶的形式表達(dá)。經(jīng)Amylose Resin親和柱純化

11、后,得到了純度在90％以上的MBP-tumstatin183-230-TRAIL和MBP-TRAIL-tumstatin183-230純化蛋白。再經(jīng)X因子切割MBP標(biāo)簽后,得到目的蛋白。通過對內(nèi)皮細(xì)胞ECV304細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)和人胰腺膽管上皮癌細(xì)胞SW1990的殺傷試驗(yàn),及管腔形成抑制試驗(yàn),結(jié)果表明tumstatin183-230-TRAIL具有良好的雙功能活性,即保持tumstatin183-230樣活性,又保持了TRAIL樣活性；