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文檔簡介
1、目的:
1.表達和純化重組的人胱抑素C(cystatin C,CysC)蛋白;
2.鑒定純化的重組CysC蛋白;
3.重組CysC蛋白的免疫活性的檢測。
方法:
1.根據(jù)GenBank中人Cys C功能區(qū)的氨基酸序列,選擇大腸埃希菌喜好的編碼密碼子設計合成編碼基因序列,利用PCR(聚合酶鏈式反應)獲取目的片段,在原核系統(tǒng)中表達重組人胱抑素C蛋白。
2.純化表達的CysC重組蛋白
2、,用間接酶聯(lián)免疫吸附測定法(間接ELISA法)測定其反應靈敏度及免疫活性。
結果:
1.PCR擴增CysC后經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,在250~500bp位置處發(fā)現(xiàn)唯一一條清晰的、大小約為450bp的DNA條帶,相對分子質量大小與Cys C基因大小相符,因此可初步確定為目的條帶。構建的重組載體pMD18-T-Cys C,經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定后可見兩條條帶,與預期結果一致,經(jīng)過上海生工公司測序,證明為C
3、ysC編碼序列;
2.將連接表達載體的連接物誘導表達,SDS-PAGE后發(fā)現(xiàn)誘導后的菌株表達了一個大小約為35kD的蛋白,而在對照組中沒有出現(xiàn)這一條帶,初步說明重組基因在大腸桿菌中獲得了有效表達;
3.Western Blotting結果顯示,表達的重組蛋白與抗Cys C多克隆抗體在大小約為35kD處發(fā)生了反應,而陰性對照則沒有此條帶的出現(xiàn),進一步說明了重組蛋白為Cys C蛋白,并且具有良好的免疫反應活性;
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