人內(nèi)皮抑素基因的克隆、重組表達(dá)、純化和活性研究.pdf

1、研究背景子宮內(nèi)膜異位癥(內(nèi)異癥)是一種育齡婦女的常見(jiàn)病，發(fā)病率逐年上升，已達(dá)10％-15％，35％～50％的不孕婦女患有該病[1]。主要引起的痛經(jīng)、不孕、性交疼痛等，嚴(yán)重影響著婦女生活質(zhì)量[2]。內(nèi)異癥真正的病因和發(fā)病機(jī)制尚不明確。現(xiàn)有的治療方法局限于激素類藥物、手術(shù)或手術(shù)聯(lián)合藥物等，雖對(duì)緩解癥狀，提高妊娠率有一定幫助，但療效有限，副作用大，復(fù)發(fā)率高[3]。近年來(lái)的研究表明，脫落的內(nèi)膜附著在腹膜或其它部位時(shí)，異位內(nèi)膜本身及其周圍組織新的

2、血供的建立和維持，是子宮內(nèi)膜異位種植存活和子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生的基本條件[4-5]。血管生成機(jī)制已成為內(nèi)異癥公認(rèn)的重要發(fā)病機(jī)制之一。因此，從血管生成理論出發(fā)，尋找內(nèi)異癥新的治療途徑，降低內(nèi)異癥復(fù)發(fā)和減少毒副作用成為可能[6]。內(nèi)皮抑素作為目前已知最強(qiáng)的內(nèi)源性血管形成抑制因子，在腫瘤的治療方面已有大量研究及應(yīng)用[7-10]，但在內(nèi)異癥的治療研究領(lǐng)域鮮有報(bào)道。 目的本研究旨在通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)，從胎肝組織克隆人內(nèi)皮抑素基因，在大腸桿菌

3、中表達(dá)，純化后得到有生物學(xué)活性的重組蛋白質(zhì)產(chǎn)物，為后續(xù)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。 方法與結(jié)果1.采用RT-PCR技術(shù)從胎肝中克隆人內(nèi)皮抑素基因全序列，構(gòu)建人內(nèi)皮抑素質(zhì)粒并測(cè)序驗(yàn)證，所獲得目的基因序列與已發(fā)表的人內(nèi)皮抑素基因序列相比，第471位氨基酸編碼堿基由G突變?yōu)锳，但編碼的氨基酸都是精氨酸，與GenBank中人內(nèi)皮抑素蛋白質(zhì)序列完全一致，屬于沉默突變型，不影響后續(xù)表達(dá)。 2.通過(guò)基因工程技術(shù)構(gòu)建了人內(nèi)皮抑素的非融合蛋白表達(dá)

4、質(zhì)粒pBV220-HumanEndostatin，并成功地在原核細(xì)胞E.coliDH5α中進(jìn)行了表達(dá)，摸索了穩(wěn)定表達(dá)的條件及包涵體的洗滌、變性、復(fù)性、純化條件，經(jīng)SP陽(yáng)離子交換層析和疏水層析兩步純化，獲得了高純度的重組蛋白樣品(95％以上)。 3.通過(guò)基因工程技術(shù)構(gòu)建了人內(nèi)皮抑素基因的融合蛋白表達(dá)載體pTRX-HumanEndostatin，并成功地在原核細(xì)胞E.coliBL21(DE3)中進(jìn)行了表達(dá)，摸索出了穩(wěn)定表達(dá)的條件及包

5、涵體的洗滌、變性和復(fù)性條件和純化工藝，通過(guò)Ni2+-ChelatingSepharose親和層析純化融合蛋白Trx-Endo，經(jīng)腸激酶(EK)酶切，酶切產(chǎn)物上Ni2+-ChelatingSepharose親和層析柱和SPSepharosFastHow陽(yáng)離子交換層析進(jìn)一步純化，獲得了高純度的重組蛋白樣品(95％以上)。 4.用MTT法進(jìn)行了重組蛋白的活性檢測(cè)，證明純化的人內(nèi)皮抑素具有明顯的抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用，隨重組蛋白濃度的增