人內皮抑素基因的克隆、重組表達、純化和活性研究.pdf

1、研究背景子宮內膜異位癥(內異癥)是一種育齡婦女的常見病，發(fā)病率逐年上升，已達10％-15％，35％～50％的不孕婦女患有該病[1]。主要引起的痛經(jīng)、不孕、性交疼痛等，嚴重影響著婦女生活質量[2]。內異癥真正的病因和發(fā)病機制尚不明確?，F(xiàn)有的治療方法局限于激素類藥物、手術或手術聯(lián)合藥物等，雖對緩解癥狀，提高妊娠率有一定幫助，但療效有限，副作用大，復發(fā)率高[3]。近年來的研究表明，脫落的內膜附著在腹膜或其它部位時，異位內膜本身及其周圍組織新的

2、血供的建立和維持，是子宮內膜異位種植存活和子宮內膜異位癥發(fā)生的基本條件[4-5]。血管生成機制已成為內異癥公認的重要發(fā)病機制之一。因此，從血管生成理論出發(fā)，尋找內異癥新的治療途徑，降低內異癥復發(fā)和減少毒副作用成為可能[6]。內皮抑素作為目前已知最強的內源性血管形成抑制因子，在腫瘤的治療方面已有大量研究及應用[7-10]，但在內異癥的治療研究領域鮮有報道。 目的本研究旨在通過分子生物學技術，從胎肝組織克隆人內皮抑素基因，在大腸桿菌

3、中表達，純化后得到有生物學活性的重組蛋白質產(chǎn)物，為后續(xù)的動物實驗奠定基礎。 方法與結果1.采用RT-PCR技術從胎肝中克隆人內皮抑素基因全序列，構建人內皮抑素質粒并測序驗證，所獲得目的基因序列與已發(fā)表的人內皮抑素基因序列相比，第471位氨基酸編碼堿基由G突變?yōu)锳，但編碼的氨基酸都是精氨酸，與GenBank中人內皮抑素蛋白質序列完全一致，屬于沉默突變型，不影響后續(xù)表達。 2.通過基因工程技術構建了人內皮抑素的非融合蛋白表達

4、質粒pBV220-HumanEndostatin，并成功地在原核細胞E.coliDH5α中進行了表達，摸索了穩(wěn)定表達的條件及包涵體的洗滌、變性、復性、純化條件，經(jīng)SP陽離子交換層析和疏水層析兩步純化，獲得了高純度的重組蛋白樣品(95％以上)。 3.通過基因工程技術構建了人內皮抑素基因的融合蛋白表達載體pTRX-HumanEndostatin，并成功地在原核細胞E.coliBL21(DE3)中進行了表達，摸索出了穩(wěn)定表達的條件及包

5、涵體的洗滌、變性和復性條件和純化工藝，通過Ni2+-ChelatingSepharose親和層析純化融合蛋白Trx-Endo，經(jīng)腸激酶(EK)酶切，酶切產(chǎn)物上Ni2+-ChelatingSepharose親和層析柱和SPSepharosFastHow陽離子交換層析進一步純化，獲得了高純度的重組蛋白樣品(95％以上)。 4.用MTT法進行了重組蛋白的活性檢測，證明純化的人內皮抑素具有明顯的抑制內皮細胞增殖的作用，隨重組蛋白濃度的增