持續(xù)胰島素輸注對膿毒癥早期大鼠肝臟線粒體損傷的保護(hù)作用.pdf

1、目的:膿毒癥（sepsis）是兒科疾病的主要死亡原因之一，若不及時治療可引起多器官功能障礙綜合征（MODS）。線粒體是細(xì)胞能量生成的主要場所，膿毒癥早期即可發(fā)生線粒體損傷，早期線粒體損傷是膿毒癥發(fā)展為MODS的重要啟動環(huán)節(jié)。因而，積極尋求有效方法保護(hù)線粒體和改善其功能是減少膿毒癥嚴(yán)重并發(fā)癥發(fā)生率和病死率的重要途徑。近年來研究表明，胰島素（insulin）除了降血糖的作用外，還有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、減少氧化應(yīng)激反應(yīng)、防止內(nèi)皮細(xì)胞損傷、改善血脂

2、代謝作用、促進(jìn)合成和抗細(xì)胞凋亡的等作用，這些作用的早期干預(yù)對防止膿毒癥進(jìn)一步發(fā)展為MODS有著重要的意義。此外，肝臟是機(jī)體進(jìn)行物質(zhì)和能量代謝的重要器官，并且在膿毒癥早期極易受損。本課題通過觀察持續(xù)胰島素輸注對膿毒癥早期大鼠肝臟功能及其線粒體膜電位、形態(tài)學(xué)、氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響和對血清TNF-α、IL-6、CRP水平及血糖水平、血脂代謝的影響，探討持續(xù)胰島素輸注對膿毒癥早期大鼠肝臟線粒體是否具有保護(hù)作用及其作用機(jī)制，為臨床上減少膿毒癥嚴(yán)重并

3、發(fā)癥的發(fā)生率和降低膿毒癥病死率提供新的方法和思路。 方法: 1．建立動物模型及分組:膿毒癥模型采用腹腔注射10mg/kg LPS建立。24只SD大鼠隨機(jī)分為3組（各組大鼠在實驗前1天行右頸外靜脈置管術(shù)）：正常對照組（n=8）：腹腔注射與靜脈泵注與其它兩組等容量的生理鹽水；LPS組（n=8）：腹腔注射LPS10mg/kg，同時持續(xù)泵注生理鹽水1ml/h；胰島素干預(yù)組（n=8）：腹腔注射LPS10mg/kg，同時持續(xù)泵注胰島

4、素生理鹽水溶液1ml/h，胰島素用量為0．25U/kg/h。 2．檢測指標(biāo)及方法 （1）大鼠一般情況 ①觀察注射LPS前20min及注射后2h、6h、12h和24h的肛溫、心率和呼吸頻率。 ②運(yùn)用快速血糖儀檢測上述各時點(diǎn)的血糖水平（BG）。 （2）大鼠炎癥反應(yīng)指標(biāo) ①運(yùn)用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA法）檢測注射LPS后2h、6h的大鼠血清TNF-α和IL-6的濃度和24h的大鼠

5、血清CRP的濃度。 （3）大鼠生化指標(biāo) ①肝功能指標(biāo)：運(yùn)用全自動生化分析儀檢測注射LPS后24h的大鼠血清ALT和AST水平。 ②脂代謝指標(biāo)：運(yùn)用全自動生化分析儀檢測注射LPS后24h的大鼠血清TG、HDL和LDL水平。 （4）大鼠肝臟粒體損傷相關(guān)指標(biāo) ①采用差速離心法提取大鼠肝臟線粒體，JC-1染料染色，流式細(xì)胞儀檢測線粒體腫脹程度和線粒體膜電位。 ②運(yùn)用比色法檢測大鼠肝臟線粒體氧化應(yīng)激

6、相關(guān)指標(biāo)（SOD、MDA）。 ③電鏡觀察大鼠肝臟線粒體損傷狀況，按照Flameng分級方法對線粒體進(jìn)行半定量評分。 3．統(tǒng)計方法 獲得的數(shù)據(jù)SPSS13．0統(tǒng)計軟件分析，結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示；多組間比較采用單因素方差分析，在多樣本均數(shù)比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義時進(jìn)行均數(shù)兩兩比較，方差齊性者采用LSD法分析組間差異，方差不齊者采用Games-Howell法分析組間差異；重復(fù)測量資料采用重復(fù)測量方差分析；相關(guān)

7、分析采用Pearson進(jìn)行檢驗；α值界定為0．05。 結(jié)果: 1．動物一般情況：LPS組和胰島素干預(yù)組均出現(xiàn)膿毒癥相關(guān)癥狀體征。與正常對照組相比，LPS組各監(jiān)測時點(diǎn)血糖水平顯著升高；與LPS組相比，胰島素干預(yù)組各監(jiān)測時點(diǎn)血糖水平顯著下降。 2．大鼠炎癥反應(yīng)指標(biāo) （1）各組大鼠血清TNF-α和IL-6水平的比較:腹腔注射LPS后2h和6h，與正常對照組相比，LPS組和胰島素干預(yù)組大鼠血清TNF-α和IL-6

8、水平顯著升高；與LPS組相比，胰島素干預(yù)組大鼠血清TNF-α和IL-6水平顯著降低。 （2）各組大鼠血清C-反應(yīng)蛋白水平的比較:腹腔注射LPS后24h，與正常對照組相比，LPS組和胰島素干預(yù)組大鼠血清CRP水平顯著升高；與LPS組相比，胰島素干預(yù)組大鼠血清CRP無顯著改變。 3．大鼠生化指標(biāo) （1）各組大鼠血清AST和AST水平的比較:腹腔注射LPS后24h，與正常對照組相比，LPS組和胰島素干預(yù)組大鼠血清ALT

9、和AST水平顯著升高；與LPS組相比，胰島素干預(yù)組大鼠血清ALT和AST水平顯著下降。 （2）各組大鼠血清TG、HDL和LDL水平的比較:腹腔注射LPS后24h，與正常對照組相比，LPS組和胰島素干預(yù)組大鼠血清TG、HDL和LDL水平均無顯著改變；與LPS組相比，胰島素干預(yù)組大鼠血清TG和HDL水平改變不顯著，而LDL水平則顯著上升。 4．大鼠肝臟線粒體指標(biāo) （1）各組大鼠肝臟線粒體腫脹程度和膜電位的比較:腹腔注

10、射LPS后24h，各組大鼠間肝臟線粒體腫脹程度的比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。腹腔注射LPS后24h，與正常對照組相比，LPS組和胰島素干預(yù)組肝臟線粒體膜電位顯著下降；而胰島素干預(yù)組肝臟線粒體膜電位與LPS組相比則顯著上升。 （2）各組大鼠肝臟線粒體SOD、MDA水平的比較:腹腔注射LPS后24h，與正常對照組相比，LPS組和胰島素干預(yù)組肝臟線粒體SOD水平顯著升高；而胰島素干預(yù)組與內(nèi)毒素血癥組相比，肝臟線粒體SOD水平則顯著降低；各組

11、大鼠肝臟線粒體MDA水平則無顯著差異。 （3）各組大鼠肝臟線粒體電鏡觀察及半定量分析:腹腔注射LPS后24h，各組大鼠肝臟線粒體電鏡觀察改變不明顯，半定量分析無顯著差異。 5．大鼠肝臟線粒體膜電位與其他指標(biāo)的相關(guān)性分析:大鼠肝臟線粒體膜電位與血清ALT和AST水平呈負(fù)相關(guān)。大鼠肝臟線粒體膜電位與血清TG、HDL和LDL水平均無顯著的相關(guān)關(guān)系。大鼠肝臟線粒體膜電位與腹腔注射LPS后6h大鼠血清TNF-α、IL-6水平呈負(fù)相

12、關(guān)。大鼠肝臟線粒體膜電位與腹腔注射LPS后6h和12h大鼠血糖水平呈負(fù)相關(guān)。 結(jié)論: 1．膿毒癥早期存在肝臟功能損傷，這種功能性損傷與線粒體功能損傷相關(guān)。 2．膿毒癥早期肝臟線粒體功能已經(jīng)明顯損傷，而其結(jié)構(gòu)尚未發(fā)生明顯改變；膿毒癥早期肝臟線粒體損傷具有可逆性，膿毒癥時肝臟線粒體的保護(hù)關(guān)鍵在于早期治療。 3．持續(xù)胰島素輸注對膿毒癥早期大鼠肝臟線粒體有明顯的保護(hù)作用，此保護(hù)作用與其降低過高的血糖水平、減輕氧化