長(zhǎng)春西汀對(duì)異丙腎上腺素誘導(dǎo)的SD大鼠心肌肥大的作用機(jī)制研究.pdf

1、心肌肥大多是高血壓性心臟病在病理學(xué)上表現(xiàn)，是導(dǎo)致心血管疾病發(fā)病率和死亡率增加的一個(gè)獨(dú)立的危險(xiǎn)因素，但其發(fā)展演變的具體機(jī)制尚不完全明確。心肌肥大是為了提供正常心搏出量的一種代償性反應(yīng)，預(yù)防和逆轉(zhuǎn)心肌肥大可以顯著改善患者的預(yù)后，因此，進(jìn)一步研究心肌肥大發(fā)生的機(jī)制是非常必要的。
　　MAPK和PI3K-AKt介導(dǎo)的信號(hào)通路是心肌肥大形成過(guò)程中的重要信號(hào)通路。研究他們的表達(dá)將有助于揭示心肌肥大及其逆轉(zhuǎn)作用的機(jī)制。細(xì)胞內(nèi)鈉離子濃度在心肌肥大

2、和心力衰竭中起關(guān)鍵作用。在心肌肥大和心力衰竭模型中Na+流入的增加或Na+內(nèi)流轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的上調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈉離子濃度增加。鈉通道蛋白5型α亞基(SCN5A)、Na+/K+-ATP酶（NKA）三種亞型和Na+/H+交換蛋白1(NHE1)，都是關(guān)鍵的細(xì)胞內(nèi)鈉通道和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。
　　長(zhǎng)春西汀具有電壓依賴性鈉通道抑制作用。長(zhǎng)春西汀抑制大鼠的心肌細(xì)胞鈉電流，其抑制心肌細(xì)胞鈉電流的作用為劑量依賴性和電壓依賴性且可逆，對(duì)鈉通道的穩(wěn)態(tài)激活和失活過(guò)程的

3、影響，可使緩慢失活的鈉電流減少。其對(duì)心肌細(xì)胞鈉通道的抑制作用與河豚毒素（TTX）具有明顯相似性。有研究表明，河豚毒素能夠抑制心肌肥大。長(zhǎng)春西汀是否也具有抑制心肌肥大的作用，有待進(jìn)一步研究。長(zhǎng)春西汀關(guān)于長(zhǎng)春西汀對(duì)心血管系統(tǒng)的影響和治療作用研究較少，還沒有涉及心肌肥大的研究。
　　體外和體內(nèi)研究表明，應(yīng)用異丙腎上腺素（ISO）是常用的建立心肌肥大模型的方法。我們將以異丙腎上腺素誘導(dǎo)形成心肌細(xì)胞和整體動(dòng)物心肌肥大模型為研究對(duì)象，運(yùn)用分子

4、生物學(xué)、生物化學(xué)、形態(tài)學(xué)等技術(shù)，研究長(zhǎng)春西汀是否能通過(guò)抑制MAPK和PI3K/Akt信號(hào)通路的激活抑制異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌肥大的發(fā)生發(fā)展，以及對(duì)細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵的鈉通道和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)鈉離子濃度的影響，觀察其對(duì)整體動(dòng)物心肌肥大模型的作用。
　　第一部分：長(zhǎng)春西汀對(duì)體外培養(yǎng)ISO誘導(dǎo)SD大鼠肥大心肌細(xì)胞的影響
　　目的：觀察長(zhǎng)春西汀對(duì)體外培養(yǎng)異丙腎上腺素（ISO）誘導(dǎo)的肥大心肌細(xì)胞的影響，探討磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K)

5、和MAPKs信號(hào)通路的調(diào)控作用；檢測(cè)心肌細(xì)胞內(nèi)鈉離子濃度和關(guān)鍵鈉通道及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，探討其在心肌肥大調(diào)控中作用。
　　方法：體外培養(yǎng)原代心肌細(xì)胞，MTT法測(cè)定長(zhǎng)春西汀對(duì)心肌細(xì)胞活性的影響，確定安全藥物濃度，心肌細(xì)胞經(jīng)過(guò)72小時(shí)培養(yǎng)，DMEM培養(yǎng)基（不含血清、酚紅）處理，分成6個(gè)組：（1）對(duì)照組（Control group）：加等量的DMEM；（2）ISO組：異丙腎上腺素（10μmol/L）；（3）Vinp1組：ISO+Vinp（

6、5μmol/L）；（4） Vinp2組：ISO+Vinp（10μmol/L）；（5）Vinp3組：ISO+Vinp（20μmol/L）；（6） Vinp4組：ISO+Vinp（40μmol/L）。應(yīng)用藥物處理48小時(shí)后，測(cè)定細(xì)胞表面積，心肌細(xì)胞蛋白含量等細(xì)胞表型變化，應(yīng)用藥物處理6小時(shí)后，反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)心肌細(xì)胞的ANP、BNP、PI3K、AKt mRNA水平，應(yīng)用蛋白印跡法檢測(cè)總的Akt和磷酸化Akt、總的ER

7、K和磷酸化ERK、總的JNK和磷酸化JNK、總的P38和磷酸化P38表達(dá)相對(duì)含量；檢測(cè)鈉通道蛋白5型α亞基(SCN5A)、Na+/K+-ATP酶（NKA）三種亞型（NKA-α1、NKA-α2、NKA-α3）、Na+/H+交換蛋白1(NHE1)的表達(dá)。使用共聚焦成像檢測(cè)載有鈉敏感性熒光染料CoroNa綠的心肌細(xì)胞中鈉離子濃度。
　　結(jié)果：（1）長(zhǎng)春西汀濃度依賴性的降低肥大心肌細(xì)胞的心肌細(xì)胞表面積和總蛋白含量，抑制肥大心肌細(xì)胞ANP、

8、BNP mRNA的表達(dá)，改善PI3K、AKt mRNA表達(dá)，增加磷酸化AKt蛋白表達(dá)，減少磷酸化ERK、P38蛋白表達(dá)。（2）長(zhǎng)春西汀抑制了ISO誘導(dǎo)的肥大心肌細(xì)胞內(nèi)鈉離子濃度的增加；ISO組和長(zhǎng)春西汀組的心肌細(xì)胞中SCN5A的蛋白表達(dá)沒有顯著變化（P＞0.05），但是在心肌細(xì)胞中，ISO使NKA-α2和NKA-α3的蛋白表達(dá)顯著降低（兩者均為P＜0.05），但是NKA-α1不受影響（P＞0.05，ISO相對(duì)于對(duì)照組）。長(zhǎng)春西汀明顯減弱

9、了ISO對(duì)NKA-α2和NKA-α3蛋白表達(dá)的抑制（P＞0.05，長(zhǎng)春西汀組相對(duì)于ISO組）。與NKA-α2和NKA-α3的蛋白表達(dá)的減少相反，ISO使得NHE-1蛋白表達(dá)顯著增加，而且增加不受長(zhǎng)春西汀的影響。
　　結(jié)論：長(zhǎng)春西汀對(duì)ISO誘導(dǎo)的心肌肥大具有抑制作用。其可能機(jī)制為：通過(guò)影響PI3K-AKt和MAPK信號(hào)通路和鈉通道的阻斷作用。
　　第二部分：長(zhǎng)春西汀對(duì)ISO誘導(dǎo)心肌肥大SD大鼠心肌重構(gòu)的影響
　　目的：研

10、究長(zhǎng)春西汀對(duì)ISO誘導(dǎo)心肌肥大SD大鼠心肌重構(gòu)的影響。
　　方法：將55只成年雄性SD大鼠隨機(jī)分成4組：對(duì)照組10只、通過(guò)ISO誘導(dǎo)建立的大鼠心肌肥大模型組45只。將心肌肥大模型組大鼠隨機(jī)分為3組：?jiǎn)渭冃募》蚀竽Ｐ徒M（ISO組）15只，治療組又分為：?jiǎn)渭冃募》蚀?長(zhǎng)春西汀10 mg（Vinp I組）15只，單純心肌肥大+長(zhǎng)春西汀20 mg（Vinp II組）15只。所有大鼠相同飼養(yǎng)條件下飼養(yǎng)，成年雄性SD大鼠清醒狀態(tài)下每日分兩次（

11、上午10點(diǎn)、晚上8點(diǎn)各1次）經(jīng)背部皮下注射5 mg/kg/d異丙腎上腺素，共連續(xù)給藥4周。對(duì)照組大鼠相同方式給予2ml生理鹽水也分兩次（上午10點(diǎn)、晚上8點(diǎn)各1次）經(jīng)背部皮下注射。對(duì)照組大鼠和心肌肥大組同時(shí)給予每日2ml生理鹽水灌胃治療； Vinp I組和Vinp II組每日分兩次（上午10點(diǎn)、晚上8點(diǎn)各1次）經(jīng)背部皮下注射5mg/kg/d異丙腎上腺素同時(shí)，分別給予長(zhǎng)春西汀10 mg/kg/d和20 mg/kg/d灌胃治療；處理4周后觀

12、察的主要指標(biāo)有：各組動(dòng)物尾動(dòng)脈血壓（代替平均動(dòng)脈壓作為衡量心臟后負(fù)荷的指標(biāo)）、左心室質(zhì)量指數(shù)、心肌肥大細(xì)胞最短直徑和橫截面積、心肌間質(zhì)膠原容積分?jǐn)?shù)以及心肌羥脯氨酸含量等各項(xiàng)心肌肥大指標(biāo)。
　　結(jié)果：（1）長(zhǎng)春西汀緩解ISO導(dǎo)致的大鼠尾動(dòng)脈血壓下降。長(zhǎng)春西汀抑制了ISO誘導(dǎo)的單純心肌肥大組左心室重量、左心室質(zhì)量指數(shù)的升高(P＜0.05)，差異具有顯著性。（2）長(zhǎng)春西汀治療組與心肌肥大組大鼠相比，心肌細(xì)胞最短徑和心肌細(xì)胞橫斷面面積下降