七鰓鰻血清中殺菌蛋白質(zhì)LIP的分離及其作用機(jī)制研究.pdf

1、免疫防御的起源與演化問(wèn)題一直是免疫學(xué)研究熱點(diǎn)之一，作為最低等脊椎動(dòng)物代表七鰓鰻，一直以來(lái)備受關(guān)注。因此，基于七鰓鰻免疫防御研究為我們更好的從進(jìn)化角度來(lái)探討免疫防御的更替過(guò)程具有重要意義。本論文利用凝膠層析和液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜技術(shù)從七鰓鰻血清中分離、純化并鑒定出發(fā)揮殺菌功能的LIP(Lamprey immunity protein)，并且對(duì)LIP殺菌機(jī)理進(jìn)行研究。
　　研究表明七鰓鰻血清具有較強(qiáng)殺菌活性;運(yùn)用凝膠過(guò)濾色譜與殺菌活性相結(jié)合的

2、檢測(cè)方法，逐步縮小血清中具有殺菌活性蛋白質(zhì)范圍;利用液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜技術(shù)對(duì)殺菌活性蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定為最終解析七鰓鰻血清中殺菌活性蛋白質(zhì)的氨基酸組成奠定基礎(chǔ)。
　　根據(jù)質(zhì)譜鑒定結(jié)果，首先利用生物信息學(xué)方法對(duì)ENSPMAP00000004567、ENSPMAP00000005857、ENSPMAP00000001744、ENSPMAP00000005891的理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)、序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育做系統(tǒng)分析;其次，利用基因工程手段對(duì)

3、Myoglobin5857、Myoglobin1744和4567進(jìn)行克隆表達(dá)及蛋白質(zhì)純化;第三，對(duì)LIP進(jìn)行大量表達(dá)并純化;第四，利用純化后的四種蛋白質(zhì)并結(jié)合抑菌實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方法，對(duì)這幾種蛋白質(zhì)的殺菌活性進(jìn)行檢測(cè)，最終確定LIP為七鰓鰻體內(nèi)發(fā)揮殺菌功能蛋白質(zhì)之一，Myoglobin5857、Myoglobin1744和4567作為一種“伴侶蛋白質(zhì)”潛在的參與LIP介導(dǎo)的殺菌過(guò)程。第五，利用抗體清除與加回實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了LIP為七鰓鰻體內(nèi)發(fā)揮

4、殺菌功能蛋白質(zhì)。
　　LIP殺菌機(jī)制進(jìn)行研究，結(jié)果表明首先LIP具有較強(qiáng)的殺菌活性;其次，LIP以多聚體的形式沉積于細(xì)菌表面并能夠與細(xì)菌細(xì)胞膜表面的磷脂酰甘油、膽固醇和甘油磷脂和脂多糖結(jié)合，同時(shí)不能夠直接與磷脂酰膽堿和肽聚糖結(jié)合;第三，與細(xì)菌結(jié)合后的LIP能夠在短時(shí)間內(nèi)誘使細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)活性氧水平明顯升高;第四，LIP誘使細(xì)菌細(xì)胞膜發(fā)生去極化現(xiàn)象，進(jìn)而對(duì)細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜產(chǎn)生破壞作用;第五，LIP最終導(dǎo)致細(xì)菌進(jìn)入以質(zhì)壁分離和內(nèi)容物外泄為特征