地衣芽孢桿菌來源β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因克隆、改造及其表達(dá).pdf

1、β-1,3-1,4-葡聚糖酶是一種重要的工業(yè)用酶,已被廣泛應(yīng)用到釀酒和飼料工業(yè)中.國內(nèi)對(duì)β-1,3-1,4-葡聚糖酶的研究還處于初級(jí)階段,天然菌株的產(chǎn)酶量及酶的性能滿足不了實(shí)際應(yīng)用.然而,分子生物學(xué)、基因工程方法的應(yīng)用為其提供了契機(jī).現(xiàn)在國內(nèi)外對(duì)β-1,3-1,4-葡聚糖酶的研究集中表現(xiàn)在構(gòu)建基因工程菌株來提高酶的產(chǎn)量和性能方面.本研究的主要目的就是通過基因工程及分子生物學(xué)方法來提高β-1,3-1,4-葡聚糖酶表達(dá)量,改善其酶學(xué)特性,為

2、目前生產(chǎn)中的問題提供有效的解決途徑.主要研究內(nèi)容及相應(yīng)結(jié)果如下: 1.天然菌株產(chǎn)酶研究在基礎(chǔ)產(chǎn)酶研究的基礎(chǔ)上對(duì)培養(yǎng)基碳氮源及發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化.結(jié)果表明,4﹪復(fù)合碳源燕麥粉、麩皮等比單一成分葡萄糖、蔗糖效果好,1﹪天然氮源蛋白胨同樣優(yōu)于無機(jī)、有機(jī)氮源.利用優(yōu)化的營養(yǎng)成分組成培養(yǎng)基,150 rpm,pn 5.0-6.0的情況下天然菌株發(fā)酵48 h得到最高的產(chǎn)酶量. 2.β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因克隆及其在大腸桿菌Esc

3、herichia.coli中表達(dá)以 B.licheniformis EGW039基因組DNA為模板擴(kuò)增獲得了編碼β-1,3-1,4-葡聚糖酶的基因648 bp,將它克隆到表達(dá)載體pET28a(+),然后轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3).重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的重組酶N末端帶有6個(gè)His標(biāo)簽,分子量達(dá)28KDa,表達(dá)量占總蛋白的60.9﹪,占細(xì)胞可溶性蛋白的12.5﹪.重組酶活力分別為1286(1﹪大麥β-葡聚糖為底物)和986(1

4、﹪地衣多糖為底物)U ml<'-1>,比活分別為2479(1﹪大麥β-葡聚糖為底物)和1906(1﹪地衣多糖為底物)U mg<'-1>.利用Ni<'2+>離子親和層析柱純化目的蛋白8.74倍,重組酶最適pH和溫度分別為5.6,40℃. 3.β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因改造及其在Pichiapastoris GS115中表達(dá)對(duì)以B.lichenformis基因組DNA為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增獲得的編碼β-1,3-1,4-葡聚糖酶

5、基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化改造,共改變102個(gè)堿基,GC含量從43.6﹪下降到41.6﹪.將優(yōu)化基因M-eg1314連接到畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K上,重組載體pPIC9K-M-egl314經(jīng)BglⅡ酶切線性化后電轉(zhuǎn)化P.pastorisGS115,通過篩選得到陽性重組子.重組酶在P.pastors GS115中實(shí)現(xiàn)了分泌表達(dá),搖瓶水平上β-1,3-1,4-葡聚糖酶活力分別為67.9(1﹪大麥β-葡聚糖為底物)和 52.3(1﹪地衣多糖為底物

6、)u ml<'-1>,較未進(jìn)行優(yōu)化的β-1,3-1,4-葡聚糖酶表達(dá)水平(4U ml<'-1>)提高了約15倍;7L發(fā)酵罐水平上蛋白分泌量達(dá)250 mg L<'-1>,酶活力達(dá)到333.7(1﹪大麥β-葡聚糖為底物)和256.7(1﹪地衣多糖為底物)U ml<'-1>,比活為1334.8(1﹪大麥β-葡聚糖為底物)和1026.8(1﹪地衣多糖為底物)Umg<'-1>,最高產(chǎn)酶水平比未優(yōu)化基因高50多倍. 重組酶由于發(fā)生糖基化作用

7、分子量高達(dá)34KDa,占總分泌蛋白的53.8﹪;最適pH和最適反應(yīng)溫度分別為6.0,45℃;FeSO<,4>,CoCl<,2>,MnSO<,4>對(duì)酶有激活作用,CuSO<,4>,EDTA,β-巰基乙醇,CaCl<,2>則對(duì)酶有抑制作用;且重組酶表現(xiàn)了嚴(yán)格的底物特異性,作用于大麥β-葡聚糖或地衣多糖的產(chǎn)物對(duì)乳酸菌等益生菌的生長有顯著促進(jìn)作用.根據(jù)SDS-PAGE電泳和酶的功能性分析證明,優(yōu)化的重組蛋白已在P.pastoris中實(shí)現(xiàn)表達(dá),且