幾丁質酶和內切葡聚糖酶編碼基因的克隆及重組芽孢桿菌的構建.pdf

1、該研究旨在從兩株生防菌中分別克隆幾丁質酶和內切葡聚糖酶的編碼基因,并進行測序.將所獲得的基因同穿梭質粒連接,轉化野生型植病生防芽孢桿菌菌株,通過平板拮抗實驗和盆栽試驗檢測獲得的轉化子對病原菌的拮抗作用的大小.本實驗室從泰安效區(qū)小麥根際及來自澳大利亞的小麥根際土樣中,經分離篩選出兩株芽孢桿菌,枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)Ap113和巨大芽孢桿菌(B.megaterium)Ap25,兩個菌株對小麥紋枯病和全蝕病都有防治

2、效果;利用幾丁質培養(yǎng)基和羧甲基纖維素培養(yǎng)基對這兩株菌進行酶活性檢測,已證實這兩株菌分別具有幾丁質酶和內切葡聚糖酶活性.幾丁質酶基因的克隆:根據(jù)GeneBank上已有的枯草芽孢桿菌幾丁質酶基因的編碼序列,設計一對簡并引物,根據(jù)引物的Tm值和GC含量選擇適宜的PCR條件進行PCR,PCR產物與pMD18-T載體連接,轉化E.coliDH5α,藍白斑篩選得到23株菌株,在幾丁質平板上篩選陽性克隆子4株.質粒分析證明克隆子中含有重組質粒,外源插

3、入片段大小為2.6kb左右,與PCR最初產物的大小一致.測序后在GeneBank上進行序列比較,該基因片段同編號為2634966的枯草芽孢桿菌全序列的2599451到2812870(功能未知)有85﹪的同源性,但同已發(fā)表的13種幾丁質酶的基因(包括枯草芽孢桿菌幾丁質酶基因)的同源性很低,只有30﹪.盡管同源性比較低,但酶活性檢測發(fā)現(xiàn)該基因片段具有幾丁質酶活性,認為此PCR片段含有幾丁質酶編碼基因的全序列或部分序列,此基因片段是一個新基因