茶樹(shù)β-1，3-葡聚糖酶基因在大腸桿菌中的表達(dá)與其抗真菌研究.pdf

1、茶樹(shù)是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，茶葉為我國(guó)主要出口創(chuàng)匯的農(nóng)產(chǎn)品。長(zhǎng)期以來(lái)，真菌病害不僅是危害茶樹(shù)生長(zhǎng)，也影響茶葉產(chǎn)量和質(zhì)量，給茶葉生產(chǎn)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，如何防治茶樹(shù)真菌病害一直是茶葉工作者非常關(guān)注的問(wèn)題。盡管化學(xué)殺蟲(chóng)劑可以部分解決茶樹(shù)病害，但是農(nóng)藥殘留對(duì)人體健康不利，且污染環(huán)境。而通過(guò)基因工程的手段，將抗病基因?qū)氩铇?shù)中，無(wú)疑前景廣闊。β-1，3-葡聚糖酶是一種病程相關(guān)蛋白，它通過(guò)水解真菌細(xì)胞壁中的葡聚糖，從而達(dá)到廣譜抑菌效果。β

2、-1，3-葡聚糖酶對(duì)大多數(shù)茶樹(shù)來(lái)說(shuō)是一種誘導(dǎo)性蛋白，在茶樹(shù)中表達(dá)量很低。因此，如果能夠?qū)⒉铇?shù)中β-1，3-葡聚糖酶基因重新轉(zhuǎn)入茶樹(shù)中，使之成為組成型表達(dá)，抑制病害的發(fā)生，同時(shí)不影響茶葉的品質(zhì)。本文通過(guò)對(duì)茶樹(shù)中β-1，3-葡聚糖酶在原核中表達(dá)，研究其生物學(xué)活性及功能特點(diǎn)，為進(jìn)一步開(kāi)展茶樹(shù)抗真菌病害的基因工程研究及運(yùn)用生物技術(shù)培育茶樹(shù)良種打下基礎(chǔ)。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明： 1．從安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶場(chǎng)和石臺(tái)大山村分別采集同一個(gè)品種的健康茶葉樣

3、品，經(jīng)過(guò)酶活檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，安農(nóng)茶場(chǎng)中的β-1，3-葡聚糖酶活性不高，而石臺(tái)大山村的茶樣中該酶活性很高。說(shuō)明環(huán)境因素對(duì)該酶的表達(dá)有著重要的影響。 2．從安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶場(chǎng)中同一株茶樹(shù)上采集不同部位的茶葉，取相同重量的茶樣進(jìn)行酶活檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，嫩葉的酶活最高。 3．選取β-1，3-葡聚糖酶活性較高的茶葉樣品作為提取RNA的實(shí)驗(yàn)材料，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)上公布的茶樹(shù)β-1，3-葡聚糖酶基因的cDNA全長(zhǎng)，設(shè)計(jì)特異引物，經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增

4、，獲得閱讀框序列，連接到表達(dá)載體pET32a上，構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)。但由于β-1，3-葡聚糖酶的閱讀框中存在與核糖體結(jié)合位點(diǎn)(ribosome binding site， RBS)區(qū)互補(bǔ)的序列，嚴(yán)重影響了基因的表達(dá)。本試驗(yàn)首次利用酶切位點(diǎn)的序列替代閱讀框上的互補(bǔ)序列，嘗試對(duì)基因進(jìn)行改造，同時(shí)保證翻譯的氨基酸序列保持不變，改造后的外源蛋白表達(dá)量有顯著提高。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，外源蛋白表達(dá)的分子量為75.8KD，與預(yù)計(jì)大小一