茶樹β-1，3-葡聚糖酶基因在大腸桿菌中的表達與其抗真菌研究.pdf

1、茶樹是我國重要的經(jīng)濟作物之一，茶葉為我國主要出口創(chuàng)匯的農產品。長期以來，真菌病害不僅是危害茶樹生長，也影響茶葉產量和質量，給茶葉生產帶來巨大的經(jīng)濟損失。因此，如何防治茶樹真菌病害一直是茶葉工作者非常關注的問題。盡管化學殺蟲劑可以部分解決茶樹病害，但是農藥殘留對人體健康不利，且污染環(huán)境。而通過基因工程的手段，將抗病基因導入茶樹中，無疑前景廣闊。β-1，3-葡聚糖酶是一種病程相關蛋白，它通過水解真菌細胞壁中的葡聚糖，從而達到廣譜抑菌效果。β

2、-1，3-葡聚糖酶對大多數(shù)茶樹來說是一種誘導性蛋白，在茶樹中表達量很低。因此，如果能夠將茶樹中β-1，3-葡聚糖酶基因重新轉入茶樹中，使之成為組成型表達，抑制病害的發(fā)生，同時不影響茶葉的品質。本文通過對茶樹中β-1，3-葡聚糖酶在原核中表達，研究其生物學活性及功能特點，為進一步開展茶樹抗真菌病害的基因工程研究及運用生物技術培育茶樹良種打下基礎。本試驗研究結果表明： 1．從安徽農業(yè)大學茶場和石臺大山村分別采集同一個品種的健康茶葉樣

3、品，經(jīng)過酶活檢測發(fā)現(xiàn)，安農茶場中的β-1，3-葡聚糖酶活性不高，而石臺大山村的茶樣中該酶活性很高。說明環(huán)境因素對該酶的表達有著重要的影響。 2．從安徽農業(yè)大學茶場中同一株茶樹上采集不同部位的茶葉，取相同重量的茶樣進行酶活檢測。結果發(fā)現(xiàn)，嫩葉的酶活最高。 3．選取β-1，3-葡聚糖酶活性較高的茶葉樣品作為提取RNA的實驗材料，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫上公布的茶樹β-1，3-葡聚糖酶基因的cDNA全長，設計特異引物，經(jīng)過PCR擴增

4、，獲得閱讀框序列，連接到表達載體pET32a上，構建重組質粒，轉入大腸桿菌中進行表達。但由于β-1，3-葡聚糖酶的閱讀框中存在與核糖體結合位點(ribosome binding site， RBS)區(qū)互補的序列，嚴重影響了基因的表達。本試驗首次利用酶切位點的序列替代閱讀框上的互補序列，嘗試對基因進行改造，同時保證翻譯的氨基酸序列保持不變，改造后的外源蛋白表達量有顯著提高。經(jīng)IPTG誘導后，外源蛋白表達的分子量為75.8KD，與預計大小一