組蛋白消去化修飾位點的鑒定.pdf

1、近些年來，科研工作者致力于更多的消去化修飾的多肽和蛋白新成員的發(fā)現(xiàn)，從而更好的解釋各種各樣的生命現(xiàn)象，填補這一領(lǐng)域的空白，但一直苦于沒有較好的研究方法。組蛋白的消去化修飾位點的鑒定亦是如此。
　　不飽和氨基酸能夠通過巰基進攻發(fā)生米歇爾共價加成，對于含有消去化修飾的蛋白和多肽的鑒定，可以通過利用巰基試劑化學(xué)標(biāo)記，最終親和富集得到特異性的消去化修飾的蛋白或者多肽。
　　分析五種組蛋白(H1、H2A、H2B、H3、H4)的氨基酸組

2、成，發(fā)現(xiàn)五種組蛋白中易發(fā)生消去化修飾的絲氨酸和蘇氨酸都占有很高的比例，說明組蛋白中很有可能含有很多消去化修飾位點。而且除了H3含有一個半胱氨酸外，其他四種組蛋白都不含有半胱氨酸。組蛋白氨基酸組成上的特殊性，不僅為實驗方法的可行性提供了可靠的依據(jù)，還為后期巰基純化過程中非特異性的去除提供了方便。對于組蛋白消去化修飾位點的鑒定，就可以選用二硫蘇糖醇(DTT)這種含有雙巰基的小分子試劑和組蛋白進行共價加成。其中，一個巰基和打開消去化修飾的不飽

3、和氨基酸，使得組蛋白帶上DDT標(biāo)簽;另一個暴露出來的巰基和巰基活化的瓊脂糖凝膠柱親和性的結(jié)合，最終純化出特異性結(jié)合的目標(biāo)蛋白。
　　首先利用選取牛腦組織，反復(fù)洗滌細胞核，通過酸提和高鹽提取的方式得到組蛋白。選取酸提的組蛋白優(yōu)化了加成反應(yīng)的最佳條件。
　　通過去垢劑性質(zhì)和小分子去除所需條件的比較，選取了甘油這種分子量較小、容易通過透析除去的去垢劑。接著，優(yōu)化出了甘油在加成反應(yīng)中最佳的反應(yīng)濃度為8％。然后，比較了幾種常見緩沖液的

4、加成反應(yīng)的強弱，結(jié)果顯示幾種緩沖液都有比較強的反應(yīng)信號，其中碳酸氫鈉最強。最后，比較了幾種溫度在加成反應(yīng)信號的強弱，結(jié)果顯示，25℃為最適反應(yīng)溫度。然后，優(yōu)化了親和富集組蛋白的最優(yōu)純化條件。
　　比較不同溫度下標(biāo)記的組蛋白掛柱效率的結(jié)果顯示:室溫孵育有較強的掛柱效率。比較在不同緩沖液中DTT化學(xué)標(biāo)記的組蛋白親和富集得到的組蛋白，結(jié)果顯示:組蛋白在Tris，NaHCO3中都有較強的掛柱效率，HEPES和NaHCO3都能夠純化到特異性

5、較強的組蛋白。最后，將純化過的組蛋進行preclean，選取高濃度的尿素去除非特異結(jié)合的蛋白，最終得到了特異性結(jié)合的組蛋白。
　　總之，本課題是建立在實驗室已經(jīng)成熟的標(biāo)記探針的基礎(chǔ)上，檢測了最佳的反應(yīng)條件，分別從緩沖液、去垢劑、反應(yīng)時間和溫度等方面進行了優(yōu)化，選擇了最適的反應(yīng)條件進行化學(xué)標(biāo)記，之后通過半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測到標(biāo)記樣品巰基自由基含量的增加，之后通過巰基活化的瓊脂糖柱子特異性的純化出了目標(biāo)蛋白。發(fā)現(xiàn)五種組蛋白都有特異性的