DNA甲基化和組蛋白修飾調(diào)節(jié)牛ZAR1基因表達(dá)的研究.pdf

1、合子阻滯因子1(ZAR1)是卵母細(xì)胞特異的母性效應(yīng)基，在胚胎早期發(fā)育的母型合子轉(zhuǎn)變中起重要作用。牛ZAR1是單拷貝基因，位于第六號染色體，基因全長4126 bp，編碼序列為1487bp，具有四個外顯子，3個內(nèi)含子，包含1155bp的開放閱讀框，編碼387個氨基酸的前體蛋白。該蛋白具有在進(jìn)化上保守的植物同源結(jié)構(gòu)域PHD，表明ZAR1具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的作用，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶和組蛋白去乙?；缚赡芡ㄟ^PHD等結(jié)構(gòu)域抑制基因轉(zhuǎn)錄。ZAR1基因編碼區(qū)

2、有大量的回文序列，能夠形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)和十字結(jié)構(gòu)從而改變DNA構(gòu)象，也可能直接和蛋白質(zhì)相互作用。短回文序列具有核受體的DNA結(jié)合域，調(diào)節(jié)核受體的表達(dá)。該基因3'非翻譯區(qū)含有UGUA序列和多聚脫腺苷化元件，與ZAR1蛋白的翻譯有關(guān)。ZAR1在小鼠卵巢中特異表達(dá)，在睪丸中不表達(dá)，ZAR1-/-小鼠可以存活，但卻是不育的。ZAR1-/-小鼠在卵巢發(fā)育、卵母細(xì)胞發(fā)生和受精后的早期階段雖然正常，但大多數(shù)來自ZAR1-/-雌性的胚胎都阻滯于合子期，約有

3、少于20%的胚胎到達(dá)2細(xì)胞期，但不能發(fā)育到4細(xì)胞。牛ZAR1在多種組織中表達(dá)，如心臟、睪丸、卵巢、骨骼肌，在胚胎發(fā)育不同階段也有表達(dá)，有關(guān)該基因表達(dá)調(diào)控的表觀遺傳學(xué)機(jī)制還未見報道。本研究利用RT-PCR，亞硫酸鹽測序PCR(PCR，BSP)、染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)，等實(shí)驗技術(shù)對成年牛組織中ZAR1基因表達(dá)情況及該基因5'調(diào)控區(qū)的DNA甲基化和組蛋白修飾進(jìn)行了研究，并利用實(shí)時定量PCR方法檢測該基因在牛卵母細(xì)胞及體外受精胚胎中的mR

4、NA表達(dá)的動態(tài)變化。主要研究內(nèi)容如下：
　　 ⑴利用RT-PCR檢測成年牛心臟、腎臟、肝臟及睪丸中ZAR1基因mRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示ZAR1基因具有組織特異性表達(dá)：ZAR1基因在睪丸中表達(dá)較高，腎臟和心臟較低，肝臟中未檢測到表達(dá)。
　　 ⑵DNA甲基化是調(diào)控基因表達(dá)的一種方式，主要發(fā)生在CpG位點(diǎn)的胞嘧啶的第5個碳原子上，DNA甲基化并不改變基因的堿基序列，而是通過調(diào)節(jié)基因的表達(dá)影響其功能。本試驗選定ZAR1基因5'調(diào)

5、控區(qū)中的11個CpG位點(diǎn)，以亞硫酸鹽處理的基因組為模板，進(jìn)行PCR并測序，檢測CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)，結(jié)果顯示：心臟中的甲基化程度明顯高于其他三種組織，說明該調(diào)控區(qū)DNA甲基化與牛ZAR1基因的組織特異性表達(dá)相關(guān)。
　　 ⑶利用染色質(zhì)免疫共沉淀方法對成年牛組織中ZAR1基因5'調(diào)控區(qū)的H3乙?；?、H3K9甲基化狀況進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示在檢測的組織中心臟組織H3乙?；潭容^高，肝臟中較低。H3乙酰化較高可能與ZAR1在心臟中有表達(dá)

6、相關(guān)；肝臟中乙?；潭容^低可能與肝臟中未檢測到ZAR1的表達(dá)相關(guān)。本試驗中沒有在四種組織中檢測到H3K9甲基化，H3K9甲基化與基因沉默相關(guān)，這一結(jié)果與ZAR1基因在所檢測的牛的幾種組織中的廣泛表達(dá)相一致。有研究表明H3K9甲基化最主要作用靶標(biāo)是衛(wèi)星簇和編碼區(qū)，而不是編碼蛋白基因的啟動子區(qū)，本研究所檢測的調(diào)控區(qū)可能不是H3K9甲基化的主要修飾位點(diǎn)。
　　 ⑷研究基因mRNA表達(dá)的方法有Northern雜交、實(shí)時熒光定量PCR及基

7、因芯片等多種方法，其中實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)不僅能進(jìn)行初步定量研究，且與常規(guī)PCR相比特異性和靈敏性更強(qiáng)。本試驗采用實(shí)時熒光定量PCR方法檢測了ZAR1在牛卵母細(xì)胞成熟過程中五個時期(GV、PMI、MI、AI-TI、MII)的mRNA表達(dá)狀況。ZAR1在生發(fā)泡和第一次減數(shù)分裂前中期表達(dá)量較高且有顯著差異，而在第一次減數(shù)分裂中期、末期和第二次減數(shù)分裂中期表達(dá)量較低且沒有顯著差異。
　　 ⑸ZAR1是胚胎發(fā)育的關(guān)鍵基因之一，檢測ZA

8、R1的表達(dá)狀況為其功能研究提供一些依據(jù)。本試驗應(yīng)用實(shí)時熒光定量PCR方法檢測了牛體外受精胚胎中ZAR1基因的表達(dá)狀況。研究結(jié)果表明ZAR1在2-細(xì)胞、4-細(xì)胞、8-細(xì)胞中表達(dá)量較高，且有顯著差異，而在桑椹胚和囊胚中表達(dá)量較低，且無顯著差異。
　　 ⑹ZAR1是卵母細(xì)胞特異性母性效應(yīng)基因，在胚胎早期發(fā)育的母型合子轉(zhuǎn)變中起重要作用。本研究表明牛ZAR1基因的表達(dá)具有組織特異性，在心臟、腎臟、睪丸中有表達(dá)，肝臟中未檢測到。對ZAR1基