結(jié)合珠蛋白在腎病綜合征激素抵抗中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、腎病綜合征(nephrotic syndrome，NS)是一種免疫炎癥性疾病，主要病理類型有微小病變(minimal change disease，MCD)、局灶節(jié)段硬化性腎小球腎炎(focalsegmental glomerulosclerosis，F(xiàn)SGS)、膜性腎病(membranous nephropathy，MN)和系膜增生性腎炎。糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid，GC)是治療的首選，患者對(duì)GC的反應(yīng)性各不相同，對(duì)激素

2、敏感患者的尿蛋白可以在使用足量激素治療后8周內(nèi)轉(zhuǎn)陰；而對(duì)激素抵抗的患者激素治療8-12周后，尿蛋白仍無(wú)明顯減少。激素抵抗型患者預(yù)后差，病情易遷延反復(fù)，最終進(jìn)入至終末期腎??；另外患者由于承受了大劑量激素治療，易導(dǎo)致激素相關(guān)副作用造成病情加重。目前，NS激素抵抗的發(fā)生機(jī)制仍不清楚，因此，研究激素抵抗的發(fā)生機(jī)制，尋找激素抵抗的早期生物學(xué)標(biāo)志物，是腎臟病研究領(lǐng)域的重點(diǎn)問(wèn)題之一。
　　 我們課題組前期工作中應(yīng)用比較蛋白質(zhì)組學(xué)方法發(fā)現(xiàn)了與N

3、S激素抵抗相關(guān)的血清差異蛋白——結(jié)合珠蛋白(haptoglobin，Hp)。Hp是血清球蛋白組分中的一種酸性糖蛋白，廣泛存在于人類和許多哺乳動(dòng)物血清和其他體液中，在肝臟、肺臟、皮膚、脂肪組織等多個(gè)臟器和組織也檢測(cè)到Hp的表達(dá)。Hp是急性期蛋白之一，具有多種功能，引起許多學(xué)者的高度重視。研究者發(fā)現(xiàn)多種免疫細(xì)胞上都有Hp的受體，但Hp的免疫調(diào)節(jié)功能相對(duì)復(fù)雜，既有正向調(diào)控也有負(fù)向調(diào)控。如Hp可促進(jìn)T、B淋巴細(xì)胞的增殖與功能分化；可以調(diào)節(jié)Th1

4、/Th2平衡；能抑制表皮內(nèi)的朗格漢斯細(xì)胞免疫功能成熟等。Hp免疫調(diào)節(jié)的具體作用尚存爭(zhēng)議，沒(méi)有定論。
　　 GC強(qiáng)大的抗炎作用使其成為臨床腎臟疾病的常規(guī)用藥。目前認(rèn)為，GC主要通過(guò)與胞漿中的糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid recepter，GR)結(jié)合，隨后GC-GR復(fù)合物轉(zhuǎn)位入細(xì)胞核，與靶基因上的糖皮質(zhì)激素反應(yīng)元件(glucocorticoidresponse element，GRE)相結(jié)合并增加或減少靶基因的表達(dá)來(lái)

5、抑制炎癥。GC與GR結(jié)合是GC作用的前提，有關(guān)激素抵抗的機(jī)制研究也多集中于GR方面，主要是GRα和GRβ。GRα可與GC結(jié)合并使其發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，GRβ不與GC結(jié)合，它能抑制GRα的活性。有研究顯示GC的生物學(xué)效應(yīng)受GRα與GRβ的數(shù)量、比例以及受體的親和力的影響。而脂皮素-1(lipocortin-1，LC-1)是GC可以直接上調(diào)表達(dá)的抗炎介質(zhì)之一，能介導(dǎo)GC的抗炎作用，在本研究中作為GC抗炎效應(yīng)的指針。
　　 目前普遍認(rèn)為，

6、免疫功能的紊亂是獲得性激素抵抗的重要機(jī)制之一。同時(shí)，已有研究表明Hp具有免疫調(diào)節(jié)的作用。我們推測(cè)Hp可能通過(guò)其免疫調(diào)節(jié)作用進(jìn)而參與激素抵抗的發(fā)生，因此，本課題將探討Hp對(duì)激素治療效應(yīng)究竟存在何種作用及其可能機(jī)制。
　　 第一部分、檢測(cè)NS患者血中Hp水平
　　 目的：
　　 對(duì)前期工作中尋找出的差異蛋白Hp做進(jìn)一步驗(yàn)證。
　　 材料和方法：
　　 2007年9月至2009年12月間中山大學(xué)附屬第一

7、醫(yī)院腎內(nèi)科的住院患者87例及健康志愿者52例。所有患者在采集血標(biāo)本時(shí)均未開(kāi)始接受腎上腺皮質(zhì)激素和(或)免疫抑制劑治療，經(jīng)臨床確定診斷為原發(fā)性腎病綜合征，其中男72例，女15例。根據(jù)后續(xù)GC治療效果將患者分為激素敏感組(5例)與激素抵抗組(37例)。WesternBlot檢測(cè)各組血清Hp蛋白表達(dá)水平。ELISA檢測(cè)各組血清Hp、C-反應(yīng)蛋白(Creactive protein，CRP)表達(dá)水平。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative

8、 real-time PCR，QPCR)檢測(cè)各組外周血單個(gè)核細(xì)胞中(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)Hp mRNA表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：
　　 1.Western blot結(jié)果顯示，激素敏感組和激素抵抗組血清Hp蛋白條帶均強(qiáng)于正常對(duì)照組血清Hp蛋白條帶，激素抵抗組血清Hp蛋白條帶強(qiáng)于激素敏感組血清Hp蛋白條帶。
　　 2.ELISA結(jié)果顯示，激素敏感組和激素抵抗組血

9、清Hp水平顯著高于正常對(duì)照組(p＜0.001)，激素抵抗組血清Hp水平顯著高于激素敏感組(p＜0.001)。
　　 3.ELISA結(jié)果顯示，激素抵抗組血清CRP水平顯著高于正常對(duì)照組(p＜0.005)，激素抵抗組與激素敏感組之間血清CRP水平的差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)，激素敏感組與正常對(duì)照組之間血清CRP水平的差異也沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。
　　 4.QPCR結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，激素敏感組和激素

10、抵抗組PBMC中HpmRNA表達(dá)水平均呈明顯上升趨勢(shì)，但其升高無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。與激素敏感組相比，激素抵抗組PBMC中Hp mRNA表達(dá)水平呈明顯上升趨勢(shì)，但其升高無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。
　　 第二部分、Hp干擾地塞米松(dexamethasone，DEX)作用的體外實(shí)驗(yàn)
　　 目的：
　　 研究Hp在NS激素抵抗中的作用及探討其可能的機(jī)制
　　 材料和方法：
　　 提取正常人

11、(6例)的PBMC接種于48孔板，分為：溶媒對(duì)照組、10-5M DEX單獨(dú)處理組、不同濃度(50ug/ml，200ug/ml，800ug/ml)Hp+DEX共同處理組，800ug/mlHp單獨(dú)處理組。人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)和人IgG作為Hp的對(duì)照蛋白。各組培養(yǎng)6小時(shí)后收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，QPCR分別檢測(cè)各組細(xì)胞LC-1mRNA、GRαmRNA、GRβ mRNA、GAPDHmRNA的表達(dá)水平

12、。
　　 結(jié)果：
　　 1.QPCR結(jié)果顯示，DEX上調(diào)LC-1 mRNA表達(dá)水平的最佳作用時(shí)間為6小時(shí)，最佳濃度為10-5M。
　　 2.QPCR結(jié)果顯示，與溶媒對(duì)照組相比，單獨(dú)加DEX組PBMC中LC-1 mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)(p＜0.05)；與單獨(dú)加DEX組比，不同濃度Hp和DEX共培養(yǎng)組PBMC中LC-1 mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)(p＜0.05)；與50ug/ml或200ug/ml Hp和DEX共培養(yǎng)

13、組相比，800ug/ml Hp和DEX共培養(yǎng)組PBMC中LC-1 mRNA表達(dá)水平的下調(diào)趨勢(shì)更加明顯，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)；與單獨(dú)加DEX組相比，不同濃度對(duì)照蛋白HSA或人IgG和DEX共培養(yǎng)組均對(duì)PBMC中LC-1 mRNA的表達(dá)水平無(wú)明顯影響(p＞0.05)；與溶媒對(duì)照組比，獨(dú)加800ug/ml Hp或?qū)φ盏鞍兹薍SA、人IgG組均對(duì)PBMC中LC-1 mRNA的表達(dá)水平無(wú)明顯影響(p＞0.05)。
　　 3.QP

14、CR結(jié)果顯示，與溶媒對(duì)照組相比，單獨(dú)加DEX組PBMC中GRαmRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)(p＜0.05)，對(duì)GRβ mRNA表達(dá)水平和GRα/GRβ mRNA比值變化無(wú)明顯影響(p＞0.05)；與單獨(dú)加DEX組相比，不同濃度Hp和DEX共培養(yǎng)組均對(duì)PBMC中GRαmRNA表達(dá)水平、GRβ mRNA表達(dá)水平、GRα/GRβmRNA比值的變化無(wú)明顯影響(p＞0.05)。
　　 全文總結(jié)：
　　 1.腎病綜合征患者血清Hp水平顯

15、著增高，且激素抵抗組顯著高于激素敏感組和正常對(duì)照組。
　　 2.血清CRP水平在激素敏感組和激素抵抗組無(wú)顯著差別，血清Hp水平在激素敏感組和激素抵抗組的差別比CRP更有顯著性，提示Hp有可能成為腎病綜合征激素抵抗的血清生物學(xué)標(biāo)志物。
　　 3.體外實(shí)驗(yàn)顯示，Hp能抑制地塞米松所上調(diào)的下游內(nèi)源性抗炎介質(zhì)LC-1mRNA的表達(dá)，提示Hp可能參與了激素抵抗的發(fā)生。
　　 4.Hp不是通過(guò)改變GRα/GRβ的比值而抑制地