Hedgehog-Gli1通路在雷奈酸鍶促進骨髓間充質干細胞成骨分化過程中的作用.pdf

1、目的：
　　觀察Hedgehog/Gli通路在Sr促使BMSCs分化為成骨細胞過程中的作用。
　　方法：
　　1.大鼠BMSCs的分離、純化及培養(yǎng)
　　取1只4周齡的SD大鼠，采用頸椎脫臼法處死大鼠后，將其浸泡在75％的乙醇中消毒5 min，取出放置在預先經紫外線消毒過的超凈臺上，在無菌條件下剪開大鼠的皮膚、肌肉，分離出兩側的股骨和脛骨，將骨周圍的肌肉和筋膜等組織盡量剔除干凈，小心剪去股骨近端及脛骨遠端使骨髓腔暴

2、露，用DMEM/F12完全培養(yǎng)基反復沖洗骨髓腔，收集含細胞的培養(yǎng)基至15 ml的無菌離心管中，1000 rpm離心5 min，離心后棄去上清液，在離心管中再加入5ml的DMEM/F12完全培養(yǎng)基重懸細胞，然后將細胞懸液接種至25 cm2的培養(yǎng)瓶中，放置于37℃、含5％CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。24 h后待細胞貼壁行首次換液，以后每隔2～3d換液1次，倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)及細胞形態(tài)，直至細胞生長達80％～90％融合時進行1∶2

3、或1∶3傳代純化。
　　2.BMSCs的成骨分化
　　待BMSCs傳代至第3-5代時，將細胞種植于培養(yǎng)皿或者培養(yǎng)板中，待細胞生長達80％～90％以上融合后，根據(jù)不同實驗組的要求加入不同的干預措施以及含10％胎牛血清、1×10-8 mol/L地塞米松、10 mmol/Lβ-甘油磷酸鈉和50 mg/L抗壞血酸的DMEM/F12培養(yǎng)液配制而成的成骨誘導液進行培養(yǎng)。
　　3.Western blot法檢測Gli1和Runx2蛋

4、白的表達
　　待BMSCs傳代培養(yǎng)至第3代時，將細胞接種在60 mm的培養(yǎng)皿中，各實驗組給予不同的干預措施后，開始操作。棄去細胞原培養(yǎng)液，用預冷的PBS洗2遍，將皿中剩余的PBS吸干，然后在皿中加入適量細胞裂解液，放置在4℃冰箱進行裂解30 min，裂解完成后收集細胞，于12000 rpm離心10 min，取上清，采用BCA蛋白定量試劑盒開始進行蛋白定量。經SDS-PAGE分離總蛋白后，將蛋白轉移至PVDF膜上。進行封閉(5％的脫

5、脂奶粉1h)，隨后開始敷抗體，分別加入Gli1抗體(1∶200)和Runx2抗體(1∶1000)，4℃過夜，然后用TBST將膜洗3遍，每遍5 min，隨后敷羊抗兔二抗(1∶4000)，常溫孵育90 min，再用TBST將膜洗3遍，每遍5min。取出膜，暗室中用ECL發(fā)光試劑進行顯色，曝光，最后采用凝膠成像系統(tǒng)掃描，進行統(tǒng)計分析。
　　4.ALP活性檢測
　　待BMSCs傳代培養(yǎng)至第3代時，將其接種于24孔板中，根據(jù)不同實驗組

6、要求給予相應的干預措施，培養(yǎng)細胞7d后，直接將上清吸去后，在培養(yǎng)板中加入適量裂解液充分裂解，裂解30～40min后，用微量移液器吸出液體（可根據(jù)需要用生理鹽水或PBS進行一定的稀釋），遵照堿性磷酸酶試劑盒的說明書添加試劑，采用酶標法在酶標儀492 nm波長下檢測細胞內ALP的活性。
　　5.茜素紅鈣結節(jié)染色
　　待細胞傳代培養(yǎng)至第3代時，將細胞接種于6孔板中（板中預先放置24mm×24mm蓋玻片）。根據(jù)不同實驗組要求給予相應

7、的干預措施，在第21d時收集細胞，按照茜素紅鈣染色試劑盒的說明書進行操作。依次予樣本固著、染色和澄清處理，隨后在倒置顯微鏡下觀察鈣結節(jié)的染色情況并進行計數(shù)。計數(shù)時每組選3個樣本，每個樣本隨機選1個視野(×100)，計數(shù)后開始統(tǒng)計各組間的差異。
　　6.RNA干擾技術
　　設計3條Gli1-siRNA和1條陰性siRNA（non-target siRNA）。整個過程均采用無RNA酶的試劑。轉染操作前，需將新買回來的siRNA凍

8、干粉按說明書配成濃度為20μmol/L的儲存液，分裝置于-20℃冰箱中儲存。待細胞傳代培養(yǎng)至第3代時，將細胞接種于細胞至培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板中，放置在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞融合至60％～70％時可進行轉染操作。根據(jù)siRNA的說明書配制siRNA-Lipofectamine2000混合液。轉染6h后，吸走轉染液，加入新鮮的完全培養(yǎng)基，根據(jù)實驗目的予不同干預措施。
　　7.統(tǒng)計學處理
　　數(shù)據(jù)經SPSS13.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學分析

9、，結果均以均數(shù)±標準差（mean±SD）來表示，組間比較使用單因素方差分析（One-way ANOVA）檢驗，在方差齊的情況下，兩兩比較使用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　1.Sr上調BMSCs的Gli1表達
　　不同濃度Sr(0.1、1、3、5 mmol/L)處理BMSCs7 d后，Gli1蛋白表達均顯著高于對照組(P＜0.01)，在Sr濃度為0～3 mmol/L范圍內呈一定的濃度趨

10、勢，且Sr濃度為3 mmol/L時，Gli1蛋白表達處于峰值;在Sr濃度為5mmol/L時，Sr對Gli1蛋白的促進作用稍減弱，但仍明顯高于對照組(P＜0.01);然而Sr濃度達到10 mmol/L時，Gli1蛋白表達則與對照組無差異（P＞0.05）。使用3 mmol/L Sr處理BMSCs3 d時，細胞內Gli1蛋白表達水平與對照組比較，差異不明顯(P＞0.05)，而處理5d、7d、14d后，Gli1表達均顯著高于對照組(P＜0.05

11、或＜0.01），且在7d時Gli1蛋白表達最多。
　　2.Hh受體阻斷劑Cy抑制Sr對Gli1蛋白的上調作用
　　3mmol/L Sr處理BMSCs7 d后，Gli1蛋白表達水平顯著高于對照組(P＜0.01)。當同時應用10μmol/L Cy和3mmol/L Sr處理BMSCs7d后，與單獨Sr組比較，Gli1蛋白表達水平顯著降低(P＜0.05);然而單獨使用10μmol/L Cy時，則對Gli1蛋白的基礎表達無明顯影響(P

12、＞0.05)。
　　3.Gli1-siRNA有效鏈的篩選
　　與non-target小干擾RNA(siRNA)組相比較，Gli1-siRNA001未能降低Gli1表達，差別無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，而Gli1-siRNA002及Gli1-siRNA003均能降低Gli1蛋白的表達(P＜0.05)，其中Gli1-siRNA002的作用最為明顯(P＜0.01)。
　　4.Gli1-siRNA抑制Sr對BMSCs Gli

13、1表達的上調作用
　　3mmol/L Sr處理BMSCs7 d，Gli1表達較對照組明顯增加(P＜0.01);Gli1-siRNA及non-target siRNA分別轉染BMSCs后，再予3mmol/L Sr處理細胞7d，Gli1-siRNA可以顯著抑制Sr對Gli1蛋白表達的促進作用（與單純Sr組比較，P＜0.01），而non-target siRNA組則對Sr促進Gli1蛋白表達的作用無明顯影響(與單純Sr組比較，P＞0.0

14、5)。
　　5.Gli1-siRNA抑制Sr對BMSCs Runx2表達的上調作用
　　3mmol/L Sr處理BMSCs7 d，Runx2表達較對照組明顯增加(P＜0.01);Gli1-siRNA及non-target siRNA分別轉染BMSCs后，再予3mmol/L Sr處理細胞7d，Gli1-siRNA可以顯著抑制Sr對Runx2蛋白表達的促進作用（與單純Sr組比較，P＜0.01），而non-target siRNA

15、組則對Sr促進Runx2蛋白表達的作用無明顯影響(與單純Sr組比較，P＞0.05)。
　　6.Gli1-siRNA拮抗Sr對ALP活性的促進作用
　　與對照組相比，3 mmol/L Sr處理BMSCs7 d明顯增加ALP活性(P＜0.01);Gli1-siRNA及non-target siRNA分別轉染BMSCs后，再予3mmol/L Sr處理細胞7d，Gli1-siRNA可以顯著抑制Sr對ALP活性的促進作用（與單純Sr組

16、比較，P＜0.01），而non-target siRNA組則對Sr促進ALP活性的作用無明顯影響(與單純Sr組比較，P＞0.05)。
　　7.Gli1-siRNA拮抗Sr對鈣結節(jié)形成的促進作用
　　3mmol/L的Sr處理BMSCs21 d后，可明顯增加鈣結節(jié)的數(shù)量（與對照組比較，P＜0.01）;Gli1-siRNA轉染BMSCs后，使Sr對鈣結節(jié)形成的促進作用受到明顯抑制（與單純Sr組比較，P＜0.01），而non-tar