雷奈酸鍶通過骨形發(fā)生蛋白-2-Smad通路促進骨髓間充質干細胞成骨分化.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、研究背景
   骨質疏松癥(Osteoporosis,OP)是一種以低骨量和骨組織微結構破壞為特征,導致骨質脆性增加和易于骨折的代謝性疾病。OP是引起老年人疼痛、骨骼變形及骨折的主要原因,也是一種低生活質量、高致殘率、高病死率的疾病,給社會和家庭帶來沉重的經濟負擔。我國骨質疏松患者居世界首位,現在約有9000萬,占總人口的7.1%,而且隨著我國老齡化社會的進程,骨質疏松癥的發(fā)病率呈升高趨勢。因此該病的預防和治療已經成為我國公共衛(wèi)

2、生事業(yè)面臨的嚴峻問題。
   現今防治骨質疏松的藥物主要經過兩個途徑起作用:促進骨的形成、抑制骨的吸收。促進骨的形成藥物有氟制劑和甲狀旁腺激素1-34;抑制骨的吸收藥物有雌激素、選擇性雌激素受體調節(jié)劑、降鈣素和雙膦酸鹽等;與上述的藥物不同,雷奈酸鍶(strontium ranelate,Sr)是首個上市(2004年10月獲歐盟批準)的具有“雙重作用”的藥物。自2009年在中國上市以來備受關注,它代表了在骨質疏松治療上一個新的發(fā)展

3、方向,但是其機制仍未完全闡明,阻礙其在臨床上的廣泛的使用,因此有關Sr的相關機制研究已成為目前抗骨質疏松研究的熱點。
   世界各地的學者在不同水平對鍶鹽進行了研究,但是其對骨的合成作用的分子機制仍未完全闡明。眾所周知,成骨細胞是從骨髓間充質干細胞(BoneMesenchymal Stem Cells,BMSCs)分化而來,目前,的研究集中在探尋鍶鹽對BMSCs的作用及可能的信號通路。為了證明鍶鹽對骨的合成作用機制,若干實驗已經

4、在細胞水平進行了闡述,如Yang F用鍶鹽處理入骨髓間充質干細胞后,發(fā)現鍶鹽可能通過Wnt通路來促進成骨分化。Peng S等發(fā)現鍶鹽能夠通過激活Ras/MAPK信號通路以及下游的轉錄因子Runx2的活性促進BMSCs的成骨分化。BMP2/Smad通路是成骨細胞形成的重要通路,BMP2是促進骨形成和誘導成骨細胞分化最重要的細胞外信號分子之一,BMP2/Smad信號通路是骨髓間充質細胞分化為成骨細胞及骨細胞外基質合成、分泌所必需的,但是該通

5、路是否在Sr促進BMSCs的成骨分化中起作用,目前國內外尚缺乏相關研究。本實驗組前期實驗已經證明:上調的BMP-2介導了Sr對BMSCs分化為成骨細胞的促進作用。本實驗將進一步觀察BMP-2/Smad通路在Sr促進BMSCs分化為成骨細胞過程中的作用。
   1.材料與研究方法
   1.1大鼠BMSCs的分離、純化及培養(yǎng)
   取4周齡SD大鼠,雌雄不限,用頸椎脫臼法處死以后,在75%酒精里浸泡消毒10min,

6、無菌條件下分離兩側股骨及脛骨,剪去股骨及脛骨的骨骺端,暴露骨髓腔,然后用DMEM-F12培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素及100μg/ml鏈霉素)不斷沖洗骨髓腔20-30遍,至骨髓腔發(fā)白,收集含細胞的DMEM-F12培養(yǎng)液,1000rpm/min離心5min,棄上清,加入3ml的DMEM-F12培養(yǎng)液重懸細胞,接種在25 cm2的培養(yǎng)瓶中,置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h或48h后予細胞首次換液去除懸浮的血

7、液細胞及未貼壁細胞。之后每隔2-3d換一次液,倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長狀況及有無污染,直至細胞生長占據培養(yǎng)瓶瓶底近90%左右時進行傳代。
   1.2大鼠BMSCs的成骨分化
   取第3-5代大鼠BMSCs,將細胞接種于培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板中,加入成骨誘導液(含10%胎牛血清、10-8mol/L地塞米松、10 mmol/Lβ-甘油磷酸鈉、50μg/ml抗壞血酸的DMEM-F12培養(yǎng)液)培養(yǎng)。
   1.3West

8、ern blotting法檢測磷酸化Smad1/5/8及Runx2蛋白表達水平
   取第3代大鼠BMSCs,將其接種于60mm培養(yǎng)皿中,給予不同的處理因素后,提取蛋白并定量,進行電泳后轉膜,敷抗體曝光,并分析結果。
   1.4小干擾RNA(SiRNA)
   取第3代大鼠BMSCs,用不含雙抗的DMEM-F12培養(yǎng)液接種于60mm培養(yǎng)皿中,待細胞增殖至70%左右時,用Lipofectamine2000轉染Sm

9、ad1 SiRNA。轉染48h后,各實驗組給予不同的處理因素,用Western blotting法檢測Smad1/5/8、磷酸化Smad1/5/8及Runx2蛋白表達;細胞連續(xù)培養(yǎng),7天時檢測ALP活性及21天時茜素紅染色檢測鈣結節(jié)。
   1.5.Real-time PCR法測定小干擾后細胞中Smad1及Runx2基因的表達
   取第3代大鼠BMSCs,接種于25mm培養(yǎng)皿,給予不同的處理因素后,提取細胞RNA進行基

10、因表達的檢測。
   1.6堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性檢測
   選取第3代大鼠BMSCs,接種于12孔板,給予不同處理因素后,培養(yǎng)7天后檢測ALP活性。先將細胞收集后用細胞裂解液充分裂解,裂解后以12000r/min高速離心10min,取上清液依照ALP酶標儀檢測試劑盒說明書進行操作,于酶標儀492nm波長處測定結果。
   1.7茜素紅鈣化結節(jié)染色
   取第3

11、代大鼠BMSCs,接種于蓋玻片上。給予不同處理因素后,培養(yǎng)21天后用細胞茜素紅鈣染色試劑對樣本進行染色,觀察鈣結節(jié)染色情況。每組取3個樣本,每樣本隨機取3個視野(×100),比較各組間的差異。
   1.8統(tǒng)計學處理
   計量資料數據以均數±標準差((x)±s)表示,所有數據經SPSS13.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學分析,組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)檢驗,兩兩比較采用LSD檢驗。P<0.05時認

12、為差異有統(tǒng)計學意義。
   2.實驗結果
   2.1 Sr上調BMSCs的磷酸化Smad1/5/8蛋白的表達
   BMSCs分別經0.1mmol/L、1mmol/L、3mmol/L、5mmol/L及10mmol/L Sr處理1h后,0.1 mmol/L Sr開始使磷酸化(p-) Smad1/5/8表達增多,但與對照組比較差異不明顯(P>0.05);Sr濃度為1mmol/L時,p-Smad1/5/8表達水平明顯

13、升高,與對照組比較,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。但是,當Sr濃度分別增加至為3mmol/L、5mmol/L及10mmol/L時,與對照組相比,對p-Smad1/5/8表達無明顯影響。另一方面,當Sr濃度為0.1mmol/L、3mmol/L、5mmol/L及10mmol/L時,與對照組相比,對Smad1/5/8表達無明顯作用(P>0.05);經1mmol/LSr分別處理BMSCs30min、1h、2h后,與對照組相比,細胞內p-S

14、mad1/5/8表達均明顯升高,其中BMSCs經Sr處理1h時,p-Smad1/5/8表達水平達到高峰,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01),在處理6h時,p-Smad1/5/8表達水平顯著下降接近對照組水平,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
   2.2 BMP-2拮抗劑noggin抑制Sr對磷酸化Smad1/5/8蛋白表達的上調作用
   BMSCs經1mmol/L Sr處理1h后,與對照組相比,細胞內p-Smad1

15、/5/8表達明顯增加,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01),先給予100ng/ml noggin預處理BMSCs2h后,可以顯著地阻斷Sr對p-Smad1/5/8表達的上調作用,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01),提示BMP-2位于Smad1/5/8的上游,介導Sr對BMSCs Smad1/5/8的激活作用。
   2.3 Sr上調BMSCs的Runx2蛋白表達
   BMSCs分別經1mmol/L、3mmol/L、5mm

16、ol/L Sr處理6h后,與對照組相比,細胞內Runx2表達均明顯升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01),其中濃度為1mmol/L時,Runx2表達水平達到最高值(P<0.01)。當Sr濃度為5mmol/L時,Runx2表達的上升幅度下降,但仍明顯高于對照組(P<0.05)。經1mmol/LSr分別處理BMSCs3h、6h、1d、3d后,與對照組相比,細胞內Runx2表達均明顯升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01),其中處理6h時,

17、細胞內Runx2表達最多。
   2.4 Smad1 SiRNA降低Smad1/5/8蛋白的表達
   BMSCs分別經Smad1 SiRNA01、Smad1 SiRNA02、Smad1 SiRNA03轉染48h,與對照組相比,在Smad1 SiRNA01、Smad1 SiRNA02、Smad1 SiRNA03組細胞內,Smad1/5/8表達均明顯下降,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),其中Smad1 SiRNA02細

18、胞內Smad1/5/8表達最少(P<0.01),所以后續(xù)的實驗選用Smad1 SiRNA02作為有效的SiRNA。
   2.5 Smad1 SiRNA抑制Sr對磷酸化Smad1/5/8蛋白表達的上調作用
   BMSCs用1mmol/L Sr處理1h后,與單獨對照組相比,細胞內p-Smad1/5/8表達明顯升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01);BMSCs經Smad1 SiRNA轉染48h后,可以顯著地阻斷Sr對p-

19、Smad1/5/8表達的上調作用(P<0.01)。
   2.6 Smad1 SiRNA抑制Sr對Runx2蛋白表達的上調作用
   BMSCs用1mmol/L Sr處理6h后,與對照組相比,細胞內Runx2表達明顯升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01); BMSCs經Smad1 SiRNA轉染48h后,可以顯著地阻斷Sr對Runx2表達的上調作用(P<0.01),提示Smad1/5/8通路介導Sr對BMSCs Run

20、x2表達的上調作用。
   2.7 Smad1 SiRNA降低Smad1基因的表達
   BMSCs經Smad1 SiRNA轉染24h,再用1mmol/L Sr處理2h后,與對照組相比,Sr組細胞內Smad1基因表達無統(tǒng)計學差異(P>0.05);與對照組相比,Si-smad1+Sr組,細胞內Smad1基因表達明顯減少,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
   2.8 Smad1 SiRNA降低Sr對Runx2基

21、因表達的促進作用
   BMSCs經Smad1 SiRNA轉染24h,再用1mmol/L Sr處理2h后,與對照組相比,Sr組細胞內Rnux2基因表達明顯增多,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01);與Sr組相比,Si-smad1+Sr組,細胞內Rnux2基因表達明顯減少,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
   2.9 Smad1 SiRNA抑制Sr對ALP活性的促進作用
   BMSCs用1mmol/L Sr處

22、理7d后,與單獨對照組相比,細胞內ALP活性顯著增加,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01); BMSCs經Smad1 SiRNA轉染48h后,抑制Sr對細胞內ALP活性的促進作用,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
   2.10 Smad1 SiRNA抑制Sr對鈣結節(jié)生成的促進作用
   BMSCs用1mmol/L Sr處理21d后,與單獨對照組相比,細胞內鈣結節(jié)數量明顯增加;在Sr處理BMSCs前,用Smad1 Si

23、RNA轉染48h,細胞內鈣結節(jié)數量明顯減少。單獨Smad1 SiRNA轉染組的鈣結節(jié)未見明顯減少。
   3.實驗結論
   (1)在BMSCs分化為成骨細胞的過程中,Sr上調了磷酸化Smad1/5/8及Runx2的表達;(2) BMP-2的拮抗劑noggin拮抗Sr對磷酸化Smad1/5/8表達的上調作用;(3)下調磷酸化Smad1/5/8的表達可抑制Sr的促成骨作用,表現為BMSCs Runx2表達減少、ALP活性降

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