雷奈酸鍶通過骨形發(fā)生蛋白-2-Smad通路促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化.pdf

1、研究背景
　　 骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis，OP)是一種以低骨量和骨組織微結(jié)構(gòu)破壞為特征，導(dǎo)致骨質(zhì)脆性增加和易于骨折的代謝性疾病。OP是引起老年人疼痛、骨骼變形及骨折的主要原因，也是一種低生活質(zhì)量、高致殘率、高病死率的疾病，給社會和家庭帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。我國骨質(zhì)疏松患者居世界首位，現(xiàn)在約有9000萬，占總?cè)丝诘?.1％，而且隨著我國老齡化社會的進(jìn)程，骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率呈升高趨勢。因此該病的預(yù)防和治療已經(jīng)成為我國公共衛(wèi)

2、生事業(yè)面臨的嚴(yán)峻問題。
　　 現(xiàn)今防治骨質(zhì)疏松的藥物主要經(jīng)過兩個途徑起作用:促進(jìn)骨的形成、抑制骨的吸收。促進(jìn)骨的形成藥物有氟制劑和甲狀旁腺激素1-34;抑制骨的吸收藥物有雌激素、選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑、降鈣素和雙膦酸鹽等;與上述的藥物不同，雷奈酸鍶(strontium ranelate，Sr)是首個上市(2004年10月獲歐盟批準(zhǔn))的具有“雙重作用”的藥物。自2009年在中國上市以來備受關(guān)注，它代表了在骨質(zhì)疏松治療上一個新的發(fā)展

3、方向，但是其機制仍未完全闡明，阻礙其在臨床上的廣泛的使用，因此有關(guān)Sr的相關(guān)機制研究已成為目前抗骨質(zhì)疏松研究的熱點。
　　 世界各地的學(xué)者在不同水平對鍶鹽進(jìn)行了研究，但是其對骨的合成作用的分子機制仍未完全闡明。眾所周知，成骨細(xì)胞是從骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BoneMesenchymal Stem Cells，BMSCs)分化而來，目前，的研究集中在探尋鍶鹽對BMSCs的作用及可能的信號通路。為了證明鍶鹽對骨的合成作用機制，若干實驗已經(jīng)

4、在細(xì)胞水平進(jìn)行了闡述，如Yang F用鍶鹽處理入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)鍶鹽可能通過Wnt通路來促進(jìn)成骨分化。Peng S等發(fā)現(xiàn)鍶鹽能夠通過激活Ras/MAPK信號通路以及下游的轉(zhuǎn)錄因子Runx2的活性促進(jìn)BMSCs的成骨分化。BMP2/Smad通路是成骨細(xì)胞形成的重要通路，BMP2是促進(jìn)骨形成和誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化最重要的細(xì)胞外信號分子之一，BMP2/Smad信號通路是骨髓間充質(zhì)細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞及骨細(xì)胞外基質(zhì)合成、分泌所必需的，但是該通

5、路是否在Sr促進(jìn)BMSCs的成骨分化中起作用，目前國內(nèi)外尚缺乏相關(guān)研究。本實驗組前期實驗已經(jīng)證明:上調(diào)的BMP-2介導(dǎo)了Sr對BMSCs分化為成骨細(xì)胞的促進(jìn)作用。本實驗將進(jìn)一步觀察BMP-2/Smad通路在Sr促進(jìn)BMSCs分化為成骨細(xì)胞過程中的作用。
　　 1.材料與研究方法
　　 1.1大鼠BMSCs的分離、純化及培養(yǎng)
　　 取4周齡SD大鼠，雌雄不限，用頸椎脫臼法處死以后，在75％酒精里浸泡消毒10min，

6、無菌條件下分離兩側(cè)股骨及脛骨，剪去股骨及脛骨的骨骺端，暴露骨髓腔，然后用DMEM-F12培養(yǎng)液（含10％胎牛血清、100 U/ml青霉素及100μg/ml鏈霉素）不斷沖洗骨髓腔20-30遍，至骨髓腔發(fā)白，收集含細(xì)胞的DMEM-F12培養(yǎng)液，1000rpm/min離心5min，棄上清，加入3ml的DMEM-F12培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，接種在25 cm2的培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5％ CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h或48h后予細(xì)胞首次換液去除懸浮的血

7、液細(xì)胞及未貼壁細(xì)胞。之后每隔2-3d換一次液，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀況及有無污染，直至細(xì)胞生長占據(jù)培養(yǎng)瓶瓶底近90％左右時進(jìn)行傳代。
　　 1.2大鼠BMSCs的成骨分化
　　 取第3-5代大鼠BMSCs，將細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板中，加入成骨誘導(dǎo)液（含10％胎牛血清、10-8mol/L地塞米松、10 mmol/Lβ-甘油磷酸鈉、50μg/ml抗壞血酸的DMEM-F12培養(yǎng)液）培養(yǎng)。
　　 1.3West

8、ern blotting法檢測磷酸化Smad1/5/8及Runx2蛋白表達(dá)水平
　　 取第3代大鼠BMSCs，將其接種于60mm培養(yǎng)皿中，給予不同的處理因素后，提取蛋白并定量，進(jìn)行電泳后轉(zhuǎn)膜，敷抗體曝光，并分析結(jié)果。
　　 1.4小干擾RNA(SiRNA)
　　 取第3代大鼠BMSCs，用不含雙抗的DMEM-F12培養(yǎng)液接種于60mm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞增殖至70％左右時，用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染Sm

9、ad1 SiRNA。轉(zhuǎn)染48h后，各實驗組給予不同的處理因素，用Western blotting法檢測Smad1/5/8、磷酸化Smad1/5/8及Runx2蛋白表達(dá);細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)，7天時檢測ALP活性及21天時茜素紅染色檢測鈣結(jié)節(jié)。
　　 1.5.Real-time PCR法測定小干擾后細(xì)胞中Smad1及Runx2基因的表達(dá)
　　 取第3代大鼠BMSCs，接種于25mm培養(yǎng)皿，給予不同的處理因素后，提取細(xì)胞RNA進(jìn)行基

10、因表達(dá)的檢測。
　　 1.6堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性檢測
　　 選取第3代大鼠BMSCs，接種于12孔板，給予不同處理因素后，培養(yǎng)7天后檢測ALP活性。先將細(xì)胞收集后用細(xì)胞裂解液充分裂解，裂解后以12000r/min高速離心10min，取上清液依照ALP酶標(biāo)儀檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，于酶標(biāo)儀492nm波長處測定結(jié)果。
　　 1.7茜素紅鈣化結(jié)節(jié)染色
　　 取第3

11、代大鼠BMSCs，接種于蓋玻片上。給予不同處理因素后，培養(yǎng)21天后用細(xì)胞茜素紅鈣染色試劑對樣本進(jìn)行染色，觀察鈣結(jié)節(jié)染色情況。每組取3個樣本，每樣本隨機取3個視野(×100)，比較各組間的差異。
　　 1.8統(tǒng)計學(xué)處理
　　 計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示，所有數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）檢驗，兩兩比較采用LSD檢驗。P＜0.05時認(rèn)

12、為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 2.實驗結(jié)果
　　 2.1 Sr上調(diào)BMSCs的磷酸化Smad1/5/8蛋白的表達(dá)
　　 BMSCs分別經(jīng)0.1mmol/L、1mmol/L、3mmol/L、5mmol/L及10mmol/L Sr處理1h后，0.1 mmol/L Sr開始使磷酸化(p-) Smad1/5/8表達(dá)增多，但與對照組比較差異不明顯(P＞0.05);Sr濃度為1mmol/L時，p-Smad1/5/8表達(dá)水平明顯

13、升高，與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。但是，當(dāng)Sr濃度分別增加至為3mmol/L、5mmol/L及10mmol/L時，與對照組相比，對p-Smad1/5/8表達(dá)無明顯影響。另一方面，當(dāng)Sr濃度為0.1mmol/L、3mmol/L、5mmol/L及10mmol/L時，與對照組相比，對Smad1/5/8表達(dá)無明顯作用(P＞0.05);經(jīng)1mmol/LSr分別處理BMSCs30min、1h、2h后，與對照組相比，細(xì)胞內(nèi)p-S

14、mad1/5/8表達(dá)均明顯升高，其中BMSCs經(jīng)Sr處理1h時，p-Smad1/5/8表達(dá)水平達(dá)到高峰，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，在處理6h時，p-Smad1/5/8表達(dá)水平顯著下降接近對照組水平，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 2.2 BMP-2拮抗劑noggin抑制Sr對磷酸化Smad1/5/8蛋白表達(dá)的上調(diào)作用
　　 BMSCs經(jīng)1mmol/L Sr處理1h后，與對照組相比，細(xì)胞內(nèi)p-Smad1

15、/5/8表達(dá)明顯增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，先給予100ng/ml noggin預(yù)處理BMSCs2h后，可以顯著地阻斷Sr對p-Smad1/5/8表達(dá)的上調(diào)作用，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，提示BMP-2位于Smad1/5/8的上游，介導(dǎo)Sr對BMSCs Smad1/5/8的激活作用。
　　 2.3 Sr上調(diào)BMSCs的Runx2蛋白表達(dá)
　　 BMSCs分別經(jīng)1mmol/L、3mmol/L、5mm

16、ol/L Sr處理6h后，與對照組相比，細(xì)胞內(nèi)Runx2表達(dá)均明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，其中濃度為1mmol/L時，Runx2表達(dá)水平達(dá)到最高值(P＜0.01)。當(dāng)Sr濃度為5mmol/L時，Runx2表達(dá)的上升幅度下降，但仍明顯高于對照組(P＜0.05)。經(jīng)1mmol/LSr分別處理BMSCs3h、6h、1d、3d后，與對照組相比，細(xì)胞內(nèi)Runx2表達(dá)均明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，其中處理6h時，

17、細(xì)胞內(nèi)Runx2表達(dá)最多。
　　 2.4 Smad1 SiRNA降低Smad1/5/8蛋白的表達(dá)
　　 BMSCs分別經(jīng)Smad1 SiRNA01、Smad1 SiRNA02、Smad1 SiRNA03轉(zhuǎn)染48h，與對照組相比，在Smad1 SiRNA01、Smad1 SiRNA02、Smad1 SiRNA03組細(xì)胞內(nèi)，Smad1/5/8表達(dá)均明顯下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，其中Smad1 SiRNA02細(xì)

18、胞內(nèi)Smad1/5/8表達(dá)最少(P＜0.01)，所以后續(xù)的實驗選用Smad1 SiRNA02作為有效的SiRNA。
　　 2.5 Smad1 SiRNA抑制Sr對磷酸化Smad1/5/8蛋白表達(dá)的上調(diào)作用
　　 BMSCs用1mmol/L Sr處理1h后，與單獨對照組相比，細(xì)胞內(nèi)p-Smad1/5/8表達(dá)明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);BMSCs經(jīng)Smad1 SiRNA轉(zhuǎn)染48h后，可以顯著地阻斷Sr對p-

19、Smad1/5/8表達(dá)的上調(diào)作用(P＜0.01)。
　　 2.6 Smad1 SiRNA抑制Sr對Runx2蛋白表達(dá)的上調(diào)作用
　　 BMSCs用1mmol/L Sr處理6h后，與對照組相比，細(xì)胞內(nèi)Runx2表達(dá)明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01); BMSCs經(jīng)Smad1 SiRNA轉(zhuǎn)染48h后，可以顯著地阻斷Sr對Runx2表達(dá)的上調(diào)作用(P＜0.01)，提示Smad1/5/8通路介導(dǎo)Sr對BMSCs Run

20、x2表達(dá)的上調(diào)作用。
　　 2.7 Smad1 SiRNA降低Smad1基因的表達(dá)
　　 BMSCs經(jīng)Smad1 SiRNA轉(zhuǎn)染24h，再用1mmol/L Sr處理2h后，與對照組相比，Sr組細(xì)胞內(nèi)Smad1基因表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05);與對照組相比，Si-smad1+Sr組，細(xì)胞內(nèi)Smad1基因表達(dá)明顯減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 2.8 Smad1 SiRNA降低Sr對Runx2基

21、因表達(dá)的促進(jìn)作用
　　 BMSCs經(jīng)Smad1 SiRNA轉(zhuǎn)染24h，再用1mmol/L Sr處理2h后，與對照組相比，Sr組細(xì)胞內(nèi)Rnux2基因表達(dá)明顯增多，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);與Sr組相比，Si-smad1+Sr組，細(xì)胞內(nèi)Rnux2基因表達(dá)明顯減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 2.9 Smad1 SiRNA抑制Sr對ALP活性的促進(jìn)作用
　　 BMSCs用1mmol/L Sr處

22、理7d后，與單獨對照組相比，細(xì)胞內(nèi)ALP活性顯著增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01); BMSCs經(jīng)Smad1 SiRNA轉(zhuǎn)染48h后，抑制Sr對細(xì)胞內(nèi)ALP活性的促進(jìn)作用，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 2.10 Smad1 SiRNA抑制Sr對鈣結(jié)節(jié)生成的促進(jìn)作用
　　 BMSCs用1mmol/L Sr處理21d后，與單獨對照組相比，細(xì)胞內(nèi)鈣結(jié)節(jié)數(shù)量明顯增加;在Sr處理BMSCs前，用Smad1 Si

23、RNA轉(zhuǎn)染48h，細(xì)胞內(nèi)鈣結(jié)節(jié)數(shù)量明顯減少。單獨Smad1 SiRNA轉(zhuǎn)染組的鈣結(jié)節(jié)未見明顯減少。
　　 3.實驗結(jié)論
　　 (1)在BMSCs分化為成骨細(xì)胞的過程中，Sr上調(diào)了磷酸化Smad1/5/8及Runx2的表達(dá);(2) BMP-2的拮抗劑noggin拮抗Sr對磷酸化Smad1/5/8表達(dá)的上調(diào)作用;(3)下調(diào)磷酸化Smad1/5/8的表達(dá)可抑制Sr的促成骨作用，表現(xiàn)為BMSCs Runx2表達(dá)減少、ALP活性降