雷奈酸鍶促進大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞分化為成骨細胞的相關(guān)研究.pdf

1、研究背景:
　　 骨質(zhì)疏松是一種病理性現(xiàn)象，骨質(zhì)疏松癥是一種退化性疾病。隨著人類壽命的延長，社會老齡化傾向越來越重，骨質(zhì)疏松癥已經(jīng)成為了嚴重影響人類生活質(zhì)量的公共健康問題。有研究顯示，2006年全國年齡在50歲以上的人群中，約有6944萬人患有骨質(zhì)疏松癥，約2億1千萬人存在低骨量。骨質(zhì)疏松癥的嚴重后果是造成骨折，其治療和護理需要大量的人力、物力和財力，給家庭和社會帶來了沉重的經(jīng)濟負擔以及心理負擔。所幸骨質(zhì)疏松癥是可防可治的，其藥

2、物預(yù)防和治療的主要目的是:緩解骨痛，提高骨量和骨質(zhì)量，降低骨折發(fā)生率。目前用于治療骨質(zhì)疏松癥的藥物大部分是基于抑制骨吸收或者是促進骨形成的作用機制，減少過度的骨代謝，維持正常的骨量與骨質(zhì)量。不過近年來隨著對骨質(zhì)疏松癥病因、發(fā)病機制及對骨代謝分子生物學的深入研究，防治骨質(zhì)疏松癥的藥物研究也有了很大進展。
　　 鍶(strontium)是人體必需的微量元素之一，參與人體內(nèi)很多生理功能和生化效應(yīng)。人工合成的鍶鹽雷奈酸鍶(stronti

3、um ranelate,Sr)是由法國Servier公司研制開發(fā)的一類新型抗骨質(zhì)疏松藥物，2004年11月在愛爾蘭首次上市，2009年在中國上市，在我國被國家食品藥品監(jiān)督局(State Food and Drug Administration，SFDA)批準的適應(yīng)癥為治療和預(yù)防絕經(jīng)后婦女的骨質(zhì)疏松癥以降低椎體和髖部骨折的危險性。該藥由2個穩(wěn)定的非放射性鍶原子以及有機部分雷奈酸組成，這一特殊的結(jié)構(gòu)對骨組織表現(xiàn)出相反的作用，即促進骨的形成并

4、抑制骨的吸收，從而有利于骨質(zhì)形成。它是新一代抗骨質(zhì)疏松藥物，代表了在骨質(zhì)疏松癥治療史上一個新的發(fā)展方向，是第一種被稱為具有雙重治療作用——促進骨形成、抑制骨吸收的新藥。骨髓間充質(zhì)干細胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)能夠保持其干細胞的表型而引起多向分化，定向誘導其向成骨分化可為研究骨組織工程、骨折修復(fù)和骨質(zhì)疏松等難題提供理論基礎(chǔ)。隨著對鍶與骨代謝關(guān)系的深入研究，有學者報道鍶可促進小鼠BMSCs和人B

5、MSCs向成骨細胞分化，能增加細胞堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)的活性、Ⅰ型膠原(Collagen TypeⅠ，COL-1)、骨鈣素(osteocalcin)等成骨細胞標志的表達，同時也能促進細胞的鈣化，但是其具體的作用機制尚不明確，其中關(guān)于絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)以及鈣感應(yīng)受體(calciumsensing receptor, Ca

6、SR)等分子學機制已有文獻報道。
　　 骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)是一組具有類似高度保守結(jié)構(gòu)的功能強大的糖蛋白，除BMP-1(bone morphogenetic protein-1，BMP-1)屬于金屬肽鏈內(nèi)切酶家族(the astacin family of metallo endopeptidases)外，其余均屬于轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming grow

7、th factor-β，TGF-β)超家族。迄今為止，在人類胚胎發(fā)生、骨骼形成、造血生成及神經(jīng)發(fā)育過程中，已經(jīng)鑒定出骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族超過20種的具有各種不同作用的成員。骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bonemorphogenetic protein-2，BMP-2)已經(jīng)成為BMPs家族里被研究最廣的成員，其功能主要是從骨折愈合、骨質(zhì)缺損以及一些脊柱融合模型中分析得出。在人類和動物的體外模型中，已經(jīng)證實BMPs可以刺激干細胞分化為成骨細胞，其中B

8、MP-2是現(xiàn)在被研究最多的一種。但在BMSCs分化為成骨細胞的過程中，若加上Sr這一種刺激因素時，是否存在著BMP-2的作用還未見報道。為此，本研究觀察了Sr對BMSCs分化為成骨細胞的促進作用，研究了其對相關(guān)成骨標記物的最佳作用濃度及最佳作用時間，最重要的是，本實驗初步研究了在Sr刺激大鼠BMSCs分化為成骨細胞的過程中，BMP-2表達的變化及其所起的作用，為探討Sr可能的促成骨機制提供新穎的實驗資料。
　　 研究方法:

9、>　　 一、大鼠BMSCs的獲取
　　 取4周齡雄性SD大鼠1只，頸椎脫臼法處死后用75％酒精浸泡5min，在無菌條件下分離出兩側(cè)股骨及脛骨，剔除表面的肌肉、筋膜等組織，剪去股骨近端和脛骨遠端，暴露骨髓腔，用含10％胎牛血清、100 U/ml青霉素及100μg/ml鏈霉素的DMEM低糖完全培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔，收集細胞，1000 r/min離心5min，棄上清，加入2ml上述DMEM培養(yǎng)液重懸細胞，種植于培養(yǎng)瓶中并吹打混勻，標

10、記為原代Po，置于37℃、5％CO2、80％相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后更換新鮮培養(yǎng)液以去除未貼壁細胞和各種雜質(zhì)，加入5ml新鮮培養(yǎng)液。此后每隔2-3d換液一次，倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長狀況，直至細胞接近80％-90％融合時進行傳代。此后每隔3-4d傳代一次。
　　 二、BMSCs的成骨分化
　　 選取第3-5代BMSCs為研究對象，根據(jù)不同實驗需要將細胞種植于培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板中，加入成骨誘導液（含10％胎牛血清、

11、100 U/ml青霉素及100μg/ml鏈霉素、10-8mol/L地塞米松、10 mmol/Lβ-甘油磷酸鈉、50μg/ml抗壞血酸的DMEM低糖培養(yǎng)基）培養(yǎng)。
　　 三、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性檢測
　　 選取第3代細胞，以約1×105/ml的密度接種于24孔板，各實驗組給予不同處理因素，于第7d采用酶標法檢測ALP活性。檢測時將細胞收集后以0.2％TritonX-100裂解液

12、及反復(fù)凍融法充分裂解，裂解后用PBS洗2遍，12000 r/min離心10min，取上清液按試劑盒說明書進行操作，于酶標儀520nm波長處測定結(jié)果。
　　 四、茜素紅鈣化結(jié)節(jié)染色
　　 選取第3代細胞，接種于24mm×24mm蓋玻片上，蓋玻片預(yù)先置于六孔板中。各實驗組給予不同處理因素后，于第21天按照細胞茜素紅鈣染色試劑盒說明書對樣本進行固定、染色及澄清處理，倒置顯微鏡下觀察鈣結(jié)節(jié)染色情況，每組取5個樣本，每樣本隨機取1

13、個視野(×100)，比較各組間的差異。
　　 五、real-time PCR法測定細胞分化中Runx2基因的表達
　　 取第3代培養(yǎng)細胞，調(diào)節(jié)細胞數(shù)為1×105/ml接種于25mm培養(yǎng)皿，每皿接種細胞懸液1mL，各實驗組給予不同的處理因素后，分別于不同時間點提取細胞RNA進行基因表達的檢測。
　　 六、Western blotting法檢測BMP-2蛋白表達水平
　　 選取第3代細胞，接種于60mm培養(yǎng)皿

14、中，各實驗組給予不同的處理因素后，用預(yù)冷的PBS洗兩遍，加入細胞裂解液，4℃裂解30min，12000 r/min離心10min，取上清液，用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒進行蛋白定量?？偟鞍捉?jīng)SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5％脫脂奶粉封閉1.5h，隨后加入BMP-2抗體(1:1000)，4℃過夜，用TBST洗3次，每次10min，加入二抗(1:2500)孵育1.5h，再用TBST洗3次，每次10min。將膜用發(fā)光試劑ECL顯色

15、，暗室曝光，凝膠成像系統(tǒng)掃描并分析結(jié)果。
　　 七、統(tǒng)計學處理
　　 計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差((x)±s)表示，應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，結(jié)果用單因素方差分析( One-way ANOVA)方法，方差齊性用LSD法進行組間多重比較，方差不齊用Dunnett’sT法進行組間多重比較。P＜0.05時認為有統(tǒng)計學差異。
　　 結(jié)果:
　　 一、BMSCs的形態(tài)學觀察
　　 原代MS

16、Cs接種時呈圓形，折光性強，與周圍混雜的大量血細胞辨識不清;原代培養(yǎng)24小時換液后去除一部分懸浮的血細胞，可見MSCs已貼壁生長，部分呈圓形，部分已開始向周圍延伸，細胞形態(tài)呈三角形、多邊形、短小梭形等，折光性好;其后經(jīng)數(shù)次換液未貼壁細胞被基本清除干凈，可見貼壁細胞迅速增殖，形態(tài)逐漸變?yōu)殚L梭形、成纖維樣，細胞排列具有一定的方向性，形成明顯集落。約7-10天細胞集落更加增多、擴大，基本鋪滿瓶底，達80％以上融合，此時可進行細胞傳代;傳代后的

17、細胞形態(tài)更加單一，多呈較均一的長梭形，分布均勻，融合成片的細胞呈漩渦狀、鋪路石樣排列，生長較原代細胞更為迅速，約3-4天可基本鋪滿瓶底。
　　 二、Sr增加BMSCs的ALP活性
　　 在BMSCs向成骨細胞分化的過程中，分別經(jīng)0mmol/L、0.1mmol/L、1mmol/L、3mmol/L、5mmol/L及7mmol/L Sr處理細胞7天，各組之間ALP活性差異有統(tǒng)計學意義(F=232.089,P=0.000)，各實

18、驗組與對照組相比ALP活性差異具有統(tǒng)計學意義（P值均＜0.05）;當Sr濃度增加至3mmol/L時，ALP活性值與各組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P值均為0.000)，且均數(shù)最大，可認為此時ALP活性增至最大。
　　 三、Sr促進BMSCs的鈣結(jié)節(jié)生成
　　 經(jīng)3mmol/L Sr處理BMSCs21天，與對照組相比細胞內(nèi)鈣結(jié)節(jié)生成增多，差異有統(tǒng)計學意義(t=-4.395,P=0.002)。
　　 四、Sr上調(diào)BMSC

19、s的Runx2表達
　　 BMSCs分別經(jīng)0mmol/L、1mmol/L、3mmol/L、5mmol/L、7mmol/L及10mmol/LSr處理7d，各組之間Runx2表達的差異有統(tǒng)計學意義(F=1120.869,P=0.000)，各實驗組與對照組相比Runx2表達差異具有統(tǒng)計學意義（P值均＜0.05）。其中當Sr濃度為1mmol/L時，與其余各實驗組相比差異均有統(tǒng)計學意義（P值均＜0.05），且此時均數(shù)最大，可認為此時Run

20、x2的表達水平達到最高值;經(jīng)1mmol/L Sr分別處理BMSCs0h、0.5h、1h、2h、4h、3d、7d及14d后，各組之間Runx2表達差異有統(tǒng)計學意義( F=438.015,P=0.002)，各實驗組與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（P值均＜0.01），當處理時間為7d時，Runx2的表達均數(shù)最大，且與其余各實驗組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P值均＜0.01），可認為Runx2的表達水平達到最高峰。
　　 五、Sr上調(diào)BMSC

21、s的BMP-2表達
　　 BMSCs分別經(jīng)0mmol/L、0.1mmol/L、1mmol/L、3mmol/L、5mmol/L及7mmol/LSr處理7d后，各組之間BMP-2表達的差異有統(tǒng)計學意義(F=59.117,P=.000)，與對照組相比，細胞內(nèi)BMP-2表達均升高，差異均具有統(tǒng)計學意義（P值均＜0.01）;其中Sr濃度為1mmol/L時BMP-2表達水平的均數(shù)最大，與其余各實驗組相比差異均有統(tǒng)計學意義（P值均＜0.05）

22、，可認為此時BMP-2表達水平達到最高值;經(jīng)1mmol/LSr分別處理BMSCs0d、1d、3d、5d、7d及10d后，各組之間BMP-2表達差異有統(tǒng)計學意義(F=75.937,P=0.013)，與對照組相比，細胞內(nèi)BMP-2表達均升高，差異均具有統(tǒng)計學意義（P值均＜0.05）;其中處理時間為7d時BMP-2表達水平的均數(shù)最大，與其余各實驗組相比差異均有統(tǒng)計學意義（P值均＜0.05），可認為此時BMP-2表達水平達到最高值。
　　

23、 六、BMP-2拮抗劑noggin抑制Sr對BMP-2表達的上調(diào)作用
　　 BMSCs經(jīng)不同處理后各組之間BMP-2表達差異有統(tǒng)計學意義(F=35.384,P=0.000)。BMSCs經(jīng)1mmol/L Sr處理7d后，與對照組相比，細胞內(nèi)BMP-2表達增加，有統(tǒng)計學意義（P=0.000）;在Sr處理BMSCs前，給予100ng/mlnoggin預(yù)處理2h后，細胞內(nèi)BMP-2表達較Sr組下降，有統(tǒng)計學意義(P=0.000)，no

24、ggin組及PBS組與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義（P值分別為0.962、0.965）。
　　 七、BMP-2拮抗劑noggin抑制Sr對ALP活性的促進作用
　　 BMSCs經(jīng)不同處理后各組之間ALP活性差異有統(tǒng)計學意義(F=906.400,P=0.000)。BMSCs經(jīng)3mmol/L Sr處理7d后，與對照組相比，細胞內(nèi)ALP活性增加，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000);在Sr處理細胞前，給予100ng/mlnoggi

25、n預(yù)處理2h后，細胞內(nèi)ALP活性降低，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000)，noggin組及PBS組與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P值分別為0.060、0.527)。
　　 八、BMP-2拮抗劑noggin抑制Sr對鈣結(jié)節(jié)生成的促進作用
　　 BMSCs經(jīng)不同處理后各組之間鈣結(jié)節(jié)數(shù)量差異有統(tǒng)計學意義(F=6.49,P=0.002)。BMSCs經(jīng)3mmol/L Sr處理21d后，與對照組相比，細胞內(nèi)鈣結(jié)節(jié)數(shù)量增加，差異有統(tǒng)計

26、學意義(P=0.002);在Sr處理細胞前，給予100ng/mlnoggin預(yù)處理2h后，細胞內(nèi)鈣結(jié)節(jié)數(shù)量減少，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000），noggin組及PBS組與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P值分別為0.875、0.754)。
　　 九、BMP-2拮抗劑noggin抑制Sr對Runx2表達的上調(diào)作用
　　 BMSCs經(jīng)不同處理后各組之間Runx2表達差異有統(tǒng)計學意義(F=95.196,P=0.000)。BMS

27、Cs經(jīng)1mmol/L Sr處理7d后，與對照組相比，細胞內(nèi)Runx2表達增加，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.022)，在Sr處理BMSCs前，給予100ng/ml noggin預(yù)處理2h后，細胞內(nèi)Runx2表達下降，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.003)，noggin組及PBS組與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P值分別為0.738、1.000)。
　　 結(jié)論:
　　 一、Sr能夠促進BMSCs分化為成骨細胞，表現(xiàn)為可增加BMSCs