c-Kit-Gαi-Gab1信號復(fù)合物在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過程中的作用.pdf

1、背景和目的：
　　骨折愈合是一個(gè)復(fù)雜的細(xì)胞組織學(xué)修復(fù)過程，包括細(xì)胞增殖、分化遷移、和多種細(xì)胞因子的調(diào)控等，其中，干細(xì)胞因子（stem cell factor，SCF）與其受體c-Kit特異性結(jié)合后，誘導(dǎo)c-Kit二聚化或寡聚化，激活下游多條信號通路，包括PI3K-Akt-mTOR通路、ERK-MAPK通路等，對骨的形成和代謝有重要調(diào)節(jié)作用。但SCF/c-Kit受體對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone Mesenchymal Stem Ce

2、lls，BMSCs）成骨分化的影響和如何激活下游PI3K-Akt-mTOR通路和ERK-MAPK通路的機(jī)制仍未完全明確。近年來，研究證實(shí)Gαi蛋白與Gab1蛋白偶聯(lián)激活酪氨酸激酶受體（Tyrosine Kinase Receptors，RTKs）下游信號通路，如：EGFR、FGFR、PDFGR等，而c-Kit受體是一種Ⅲ型RTKs受體，也可能通過Gαi蛋白介導(dǎo)下游信號通路。因此，本研究著重探索SCF對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化影響，并探討

3、 c-Kit-Gαi/Gab1復(fù)合物介導(dǎo) SCF激活下游信號通路的內(nèi)在機(jī)制。
　　方法：
　　(1)取對數(shù)生長期細(xì)胞，以0、50、100ng/mL SCF處理MG63、U-2OS和BMSCs細(xì)胞48小時(shí)或者14天，用MTT法和集落形成實(shí)驗(yàn)檢測SCF對BMSCs和成骨細(xì)胞增殖的作用。(2)以0、100ng/mL SCF和/或1μM地塞米松處理BMSCs24小時(shí)，用流式細(xì)胞術(shù)檢測SCF抗地塞米松誘導(dǎo)BMSCs細(xì)胞凋亡作用。(3)

4、以Gαi-shRNA慢病毒干擾BMSCs Gαi蛋白表達(dá)后，以0、50、100ng/mLSCF或者成骨誘導(dǎo)劑（10-8 mol/L地塞米松、5μg/ml抗壞血酸和10mmol/Lβ磷酸甘油酸）處理BMSCs7天，用ALP染色法和ALP活性檢測試劑盒檢測BMSCs成骨分化。(4)為了探索Gαi和Gab1蛋白在SCF/c-Kit信號傳導(dǎo)中的作用，本研究以野生型小鼠成纖維細(xì)胞（Mouse embryonic fibroblasts，MEFs）

5、和不同基因敲除型成纖維細(xì)胞為研究對象，并應(yīng)用慢病毒干擾技術(shù)阻斷野生型小鼠胚胎成纖維細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 Gαi蛋白表達(dá)以及用脂質(zhì)體作為載體向Gαi1/3雙基因敲除型MEFs導(dǎo)入外源性Gαi蛋白后，用Western blot檢測SCF誘導(dǎo)BMSCs和MEFs相關(guān)細(xì)胞Akt(Thr308和Ser473)、mTORC1、S6、GSK、Gab1、c-Kit、S6K、ERK蛋白表達(dá)及活性改變。免疫共沉淀方法檢測Gαi-Gab1復(fù)合物與c-Kit

6、受體偶聯(lián)情況。
　　結(jié)果：
　　(1)SCF促進(jìn)MG63、U-2OS成骨細(xì)胞和BMSCs體外增殖和克隆形成（p<0.05）。(2)SCF抑制地塞米松誘導(dǎo)BMSCs凋亡作用（p<0.05）。(3)ALP染色及活性檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，SCF增加了 ALP陽性細(xì)胞數(shù)量和 ALP活性（p<0.05），而Gαi-shRNA干擾BMSCs后，ALP陽性細(xì)胞數(shù)量和ALP活性無明顯增加（p>0.05）。(4)Western Blot

7、結(jié)果顯示，c-Kit受體表達(dá)于MG63、U-2OS成骨細(xì)胞和BMSCs，并被SCF激活。SCF誘導(dǎo)BMSCs和MEFs Akt-mTORC1和ERK-MAPK信號通路相關(guān)分子Akt(Thr308和Ser473)、mTORC1、S6、GSK、Gab1、S6K、ERK蛋白以及 c-Kit受體磷酸化，而基因敲除或者shRNA干擾技術(shù)阻斷Gαi1、Gαi3或Gab1蛋白表達(dá)后，SCF不能誘導(dǎo)BMSCs和MEFsAkt(Thr308和Ser473

8、)、mTORC1、S6、GSK、Gab1、S6K、ERK蛋白以及 c-Kit受體磷酸化。外源性導(dǎo)入Gαi1或Gαi3蛋白到Gαi1/3雙基因敲除型MEFs（DKO）細(xì)胞后，SCF能誘導(dǎo)MEFsAkt(Thr308和Ser473)、mTORC1、S6、GSK、Gab1、S6K、ERK蛋白以及 c-Kit受體磷酸化。免疫共沉淀結(jié)果顯示在BMSCs和MEFs中，Gαi/Gab1復(fù)合物均能與c-Kit受體發(fā)生偶聯(lián)。
　　結(jié)論：