甲基營(yíng)養(yǎng)菌Methylobacterium sp MB200中絲氨酸循環(huán)相關(guān)基因（glyA、hpr）的研究與應(yīng)用.pdf

1、甲基營(yíng)養(yǎng)菌是一類能利用甲基化合物為唯一碳源和能源的微生物，已有不少研究發(fā)現(xiàn)該類微生物能轉(zhuǎn)化甲醇為多種有價(jià)值的化合物。前期的工作已從環(huán)境中篩選到一株能以甲醇為唯一碳源和能源的甲基營(yíng)養(yǎng)桿菌菌株M.sp.MB200，該菌株利用絲氨酸循環(huán)途徑來同化甲基化合物。為了提高其L-絲氨酸和乙醛酸的積累能力，通過研究和利用M.sp.MB200中與絲氨酸循環(huán)途徑相關(guān)的關(guān)鍵基因glyA和hpr建重組菌株，以提高重組菌生物轉(zhuǎn)化甲醇的能力。 glyA基因

2、是甲基營(yíng)養(yǎng)型細(xì)菌中用于同化單碳化合物的絲氨酸循環(huán)中的第一個(gè)酶基因，它編碼的絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(SHMT)能可逆地催化甲叉四氫葉酸與甘氨酸結(jié)合生成L-絲氨酸。構(gòu)建M.sp.MB200的部分DNA文庫(kù)，從文庫(kù)中的陽性克隆中得到一個(gè)帶有啟動(dòng)子的glyA基因，該基因的開放閱讀框編碼434個(gè)氨基酸，計(jì)算分子量為48.23kDa，與已報(bào)道的M.extorquensAM1的glyA基因的核苷酸序列相似性為95％，它的氨基酸序列與M.extorquen

3、s AM1的SHMT氨基酸序列相似性為94％。通過pK18mob載體同源單交換構(gòu)建了glyA基因的突變體MB200gTB，研究發(fā)現(xiàn)該突變體不能在以甲醇為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，但在多碳化合物上的生長(zhǎng)并不受影響。突變體檢測(cè)不到SHMT酶活性，也不能利用靜息細(xì)胞體系產(chǎn)L-絲氨酸。該基因在大腸桿菌中能表達(dá)出SHMT酶活性。進(jìn)一步將該基因連同其啟動(dòng)子一起克隆到廣泛宿主載體pLAFR3上，并導(dǎo)入到出發(fā)菌株彪sp.MB200中，得到重組菌株M.sp

4、.MB202。研究發(fā)現(xiàn)M.sp.MB202中的SHMT活性為野生菌株M.sp.MB200的3.5倍，利用靜息細(xì)胞產(chǎn)L-絲氨酸的能力達(dá)到了11.4±0.6mg/mL，與出發(fā)菌株相比提高了約5倍。對(duì)重組菌的靜息細(xì)胞產(chǎn)L-絲氨酸的條件進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在50mg/mL濕菌體，甲醇濃度為70mg/mL，甘氨酸濃度為50 mg/mL，pH為8.8，溫度為37℃，發(fā)酵48小時(shí)的條件下，MB202產(chǎn)L-絲氨酸的能力達(dá)到最佳，達(dá)到24.3±1.

5、0 mg/mL。對(duì)固定化MB202細(xì)胞產(chǎn)L-絲氨酸也進(jìn)行了研究，在0.3 g/mL菌體量、3％海藻酸鈉、6％的CaCL2的條件下，能發(fā)酵5批次，平均每批次產(chǎn)12.7±0.9mg的L-絲氨酸。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步利用甲醇利用菌和glyA基因生產(chǎn)L-絲氨酸提供了應(yīng)用依據(jù)。 羥基丙酮酸還原酶基因(hpr)編碼的羥基丙酮酸還原酶能催化羥基丙酮酸鹽還原成甘油酸，甘油酸進(jìn)一步被代謝為乙醛酸。通過PCR擴(kuò)增從M.sp．MB200菌株中得到一個(gè)hp

6、r基因，該基因的大小與已報(bào)道的細(xì)菌中hpr基因大小相似。ORF大小為945bp，編碼315個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，計(jì)算分子量約為37 KDa。經(jīng)過初步的酶學(xué)特性分析發(fā)現(xiàn)，該HPR以NADPH作為輔酶，最適作用的pH值為5.5，酶的活性隨溫度的變化影響并不大。通過pK18mob載體同源單交換構(gòu)建了hpr基因的突變體MB200hTB，研究發(fā)現(xiàn)該突變體不能在以甲醇為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，但在多碳化合物上的生長(zhǎng)并不受影響，突變體檢測(cè)不到HPR酶活性

7、。利用廣泛宿主載體pLAFR3帶上hpr基因，導(dǎo)入到出發(fā)菌株MB200中，在lacZ啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下使得MB200中的hpr基因拷貝數(shù)增加，從而提高細(xì)胞內(nèi)HPR的酶活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明重組菌株MB201中HPR的酶活性比野生型菌株MB200的高了2倍。菌株MB200和MB201均在多數(shù)生長(zhǎng)后期時(shí)乙醛酸的含量達(dá)到最高，培養(yǎng)33小時(shí)后，MB201的乙醛酸含量為14.4±1.1 mg/mL，約為野生菌MB200的2倍。 在利用微生物轉(zhuǎn)化合成