金黃色葡萄球菌中含絲氨酸-天冬氨酸重復序列的基因的分子研究.pdf

1、很多重要的致病菌可以通過水平基因轉移(Horizontal gene transfer)獲得毒力因子和抗生素抗性基因，因此水平基因轉移被認為是細菌基因組進化的主要驅動力之一，而比較基因組學分析則是鑒定病原菌中水平基因轉移的重要工具。絲氨酸-天冬氨酸二肽重復序列(sdr)基因是細菌細胞表面蛋白，預計和細菌侵染宿主有關，目前逐漸受到重視。然而相關報道還非常少。為了比較不同宿主來源的金黃色葡萄球菌基因組的序列差異性，在本論文第一部分第一章的研

2、究中，我們比對分析了21株已公布的全基因組測序的金黃色葡萄球菌、以及218株加拿大奶牛乳腺炎相關的金黃色葡萄球菌中的4個sdr基因。結果表明奶牛乳腺炎來源的金黃色葡萄球菌(RF122及本研究中所用菌)，綿羊乳腺炎來源的菌株(ED133)，豬、牛、人多宿主來源菌株(ST398)，患有BCO癥的雞來源的菌株(ED98)，以及來源于人并具有甲氧西林抗性的菌株(TCH130、MRSA252、Mu3、Mu50、N315、04-02981、JH1、

3、JH9)之間往往含有相同的sdr基因。這提示著sdr基因可以在不同菌株之間進行水平轉移，進而增強了金黃色葡萄球菌獲得毒力因子的效率。其次，我們在多個sdr基因內發(fā)現(xiàn)一些插入突變和缺失突變，且鑒定獲得一個新的插入序列，其插入到sdrC基因，可能和sdrC基因在不同菌株之間的水平基因轉移有關。第三，我們利用sdr基因對金黃色葡萄球菌進行了分型，分型結果可以清晰表現(xiàn)菌株之間的進化差異性和關聯(lián)性，并且該分型方法比常規(guī)的MLST分型方法或者PFG

4、E方法更精確、方便、花費少。第四，我們還發(fā)現(xiàn)sdr基因和致病菌或隱性菌有很強的關聯(lián)性，比如絕大部分致病菌含有sdrD基因，而隱性菌則很少含有該基因。第五，傳統(tǒng)的針對細胞粘附因子、侵染因子、以及毒素等毒力因子的分布研究往往只檢查很短的基因保守區(qū)，而我們本次分布研究檢測了這些因子的全長序列或者其全長功能區(qū)域，發(fā)現(xiàn)這些毒力因子內包含大量的突變，這些突變會深刻影響該毒力因子的功能。因此僅檢查很短的保守區(qū)的傳統(tǒng)基因分布研究方法是不精確、不可信的，

5、本研究手段對于基因分布研究也有廣泛的借鑒意義?？傊?，本研究最重要的發(fā)現(xiàn)是證實金黃色葡萄球菌之間可以通過水平基因轉移從臨近菌株獲得致病基因。而當前人口流動加速、畜牧學迅速發(fā)展可能不經(jīng)意間提高了細菌病原體之間的接觸機會，加快了細菌病原體的進化速度。因此，本章研究對于細菌抗藥性研究以及畜牧學發(fā)展等方面有重大指導意義。
　　原核生物或者真核生物中的串聯(lián)重復序列(包括微衛(wèi)星DNA和小衛(wèi)星DNA)是易突變DNA，而針對原核生物基因組的小衛(wèi)星D

6、NA的研究非常少。細菌(尤其是葡萄球菌）細胞表面的黏附因子通常包含絲氨酸-天冬氨酸二肽(SD)重復序列，這種SD重復序列由一種小衛(wèi)星DNA編碼，對SD重復序列的功能研究將加深對原核生物小衛(wèi)星DNA的理解。在第二章研究中，我們通過生物信息學分析首先研究了SD重復序列在自然界所有已知蛋白中的分布狀況，再利用基于質粒的測試方式檢測了SD重復序列的穩(wěn)定性。研究結果發(fā)現(xiàn)SD重復序列主要存在于細菌細胞表面蛋白。分析其拷貝數(shù)量變化方式，我們發(fā)現(xiàn)SD重

7、復序列具有不穩(wěn)定性和多態(tài)性。最重要的是，其拷貝數(shù)量的變化是可逆的，并且整個變化過程不會發(fā)生移碼突變。此外，我們發(fā)現(xiàn)了一個新的序列重排熱點，ATTC/AGRT位點，該位點和SD重復序列的不穩(wěn)定性及可逆性有關。SD重復序列的這些特征使得細菌可以低成本、低風險、高效率快速應對外界環(huán)境變化，增加其在惡劣環(huán)境中生存的幾率。因此，我們提出把SD重復序列作為細菌應急位點，它是細菌適應環(huán)境波動的重要方式之一，并且應該廣受重視。
　　在第二部分的研

8、究中我們通過定向進化，提高了來自非培養(yǎng)瘤胃真菌Neocallimastigales的11家族木聚糖酶XynR8的熱穩(wěn)定性。通過高通量96孔掃描系統(tǒng)，我們對木聚糖酶突變子庫進行了篩選。75℃熱處理5分鐘后，木聚糖酶XynR8野生型喪失80％酶活，而定向進化獲得的三個突變子表現(xiàn)出了比野生型更高的熱穩(wěn)定性。三個突變子共含有五個氨基酸突變，分別為:I38V、A104T、F116L、D137G、G151D。隨后，我們利用DNA改組技術和定點突變進

9、一步鑒定這5個位點對于熱穩(wěn)定性提高的具體效應，發(fā)現(xiàn)突變位點I38V、D137G、G151D對于蛋白熱穩(wěn)定性提高是有積極作用的。我們又通過RosettaDesign軟件進行飽和突變預測分析，按照分析結果，38、137、151三個位點被突變?yōu)槠渌?個代表性氨基酸，來篩選每個位點熱穩(wěn)定性最高的氨基酸?；谠摵Y選結果，我們通過DNA改組技術最終獲得了熱穩(wěn)定性最高的突變子XynR8_VNE。該突變子包含3個突變I38V、D137N、G151E，T