假單胞菌轉(zhuǎn)化DL-ATC合成L-Cys相關(guān)酶的分離純化.pdf

1、L-半胱氨酸是一種重要的含硫氨基酸,廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝品以及飼料工業(yè).該實驗室從土壤中篩選獲得了一株假單胞菌TS-1138,可轉(zhuǎn)化DL-ATC合成L-半胱氨酸.該研究從產(chǎn)酶及酶促反應(yīng)條件優(yōu)化、關(guān)鍵酶的分離純化、酶學(xué)性質(zhì)以及菌株的微膠囊固定化等方面進行了研究,研究結(jié)果如下:在單因素實驗的基礎(chǔ)上應(yīng)用正交實驗確定出假單胞菌TS-U38最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)基配方為(g/L):葡萄糖30,DL-ATC 3,玉米漿2,尿素3,MnSO4·5H2O

2、0.007,K2HPO4 3,FeSO4·7H2O 0.01,MgSO4·7H2O 0.5,NaCl 1.5,pH 7.5;于28℃、140r/min搖床培養(yǎng)16h后,細胞濃度和酶活力分別比優(yōu)化前提高29.9﹪和23.8﹪.建立了最佳酶促反應(yīng)條件:完整細胞酶液(細胞培養(yǎng)液5倍濃縮)在43℃、pH8.0、DL-ATC底物濃度6g/L時,進行酶促反應(yīng)時轉(zhuǎn)化率最高達到59.9﹪;超聲波破壁后酶液(5倍濃縮)在37℃、pH8.0、DL-ATC底

3、物濃度為6g/L時進行酶促反應(yīng)時轉(zhuǎn)化率最高達到79.1﹪.采用去除核酸、鹽析、凝膠過濾和離子交換等手段分離純化得到電泳純的L-ATC水解酶、L-SCC酰胺水解酶和L-Cys脫巰基酶,分子量分別為37.5、42.8和53.0KDa,三個酶的最適反應(yīng)溫度均為35℃,最適反應(yīng)pH值分別為7.0、8.0和7.0,均為嗜中溫型酶,在pH6.0~pH9.0的范圍內(nèi)有較好的穩(wěn)定性;三個酶的Km值分別為0.67 mmol/L、0.15 mmol/L和2

4、.37mmol/L,最大反應(yīng)速度分別為0.39×10-3mmol/L·min、0.42×10-3mmol/L·min和O.11×10-3mmol/L·min.應(yīng)用非均相反應(yīng)合成了微膠囊固定化材料NaCS,并利用NaCS-PDMDAAC微膠囊對TS-1138菌株進行了固定化,培養(yǎng)132h后膠囊內(nèi)的菌濃為游離培養(yǎng)細胞的6倍,催化活性為游離培養(yǎng)細胞的2.5倍;微囊化細胞靜態(tài)、動態(tài)轉(zhuǎn)化DL-ATC合成L-半胱氨酸的研究表明,靜態(tài)轉(zhuǎn)化比動態(tài)轉(zhuǎn)化在