林麝源銅綠假單胞菌的分離鑒定及毒力研究.pdf

1、本試驗結(jié)合傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)鑒定方法和分子生物學(xué)方法，從發(fā)病死亡的林麝肺組織和肝組織中分離鑒定出了三株銅綠假單胞菌，提取分離株的粗毒素并作用于家兔外周血淋巴細(xì)胞，觀察粗毒素對淋巴細(xì)胞的增殖影響。
　　根據(jù)文獻(xiàn)合成保守性通用引物，對PAsp-1、PAsp-2、PAsp-3的16SrDNA進行擴增和目標(biāo)片段測序，將測序結(jié)果在NCBI上進行相似性比較，運用生物學(xué)軟件DNAstar7.1進行發(fā)育樹的構(gòu)建，并結(jié)合常規(guī)的細(xì)菌學(xué)鑒定結(jié)果，最終確定PAs

2、p-1、PAsp-2、PAsp-3為銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。
　　采用單因素試驗對各菌株的培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化，確定了PAsp-1、PAsp-2和PAsp-3的最佳液體培養(yǎng)條件均為:溫度40℃，pH值6.5。在上述最佳條件下培養(yǎng)銅綠假單胞菌，三株菌的增殖速度均在6-14h最快，在14h時達(dá)到峰值。
　　藥物敏感性試驗結(jié)果顯示，PAsp-1、PAsp-2和PAsp-3均對慶大霉素、丁胺卡那霉

3、素、哌拉西林、頭孢他啶、頭孢哌酮、環(huán)丙沙星敏感;對羧芐青霉素、四環(huán)素和頭孢曲松中度敏感;對青霉素、頭孢唑啉、氨芐西林、紅霉素、復(fù)方新諾明和美滿霉素具有耐藥性。致病性試驗采用小鼠腹腔注射1ml/只，濃度分別為2.00×107cfu/ml、2.20×107cfu/ml、2.40×107cfu/ml、2.60×107cuf/ml和2.80×107cfu/ml的細(xì)菌培養(yǎng)物，PAsp-1、PAsp-2和PAsp-3的半數(shù)致死量(LD50)分別為2

4、.591×107CFU/ml、2.577×107CFU/ml和2.634×107CFU/ml。
　　淋巴細(xì)胞增殖試驗中，通過粗提毒素蛋白含量的測定，確定了PAsp-1、PAsp-2和PAsp-3的最佳毒素蛋白提取時間為48h，其毒素濃度分別為7.137mg/ml、9.021 mg/ml和7.876mg/ml。從兔外周血中分離淋巴細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)達(dá)2.5×106個/ml，活細(xì)胞百分率達(dá)96.8％。PAsp-1、PAsp-2和PAsp-3