十字花科黑腐病菌鋅吸收調(diào)控蛋白基因zur啟動(dòng)子的研究.pdf

1、在細(xì)菌中，鋅吸收調(diào)控蛋白Zur(zinc uptake regulator)(由zur基因編碼)的主要功能是當(dāng)細(xì)胞內(nèi)鋅離子濃度過高時(shí)抑制鋅吸收系統(tǒng)的表達(dá)。但是，本實(shí)驗(yàn)室的研究表明，在十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv．campestris)中，zur(基因編號(hào)為XC1430)除了調(diào)控鋅離子平衡外，還參與了該菌的致病過程和EPS產(chǎn)生。在完成zur基因的功能鑒定后，本實(shí)驗(yàn)室還對(duì)zur基因的啟動(dòng)子進(jìn)行了初步研

2、究，推測zur基因可能存在兩個(gè)獨(dú)立的啟動(dòng)子P1(基因組注釋的ATG前面114 bp)和P2(基因組注釋的zur基因讀碼框內(nèi)，ATG下游63 bp處的另一個(gè)翻譯起始密碼子GTG前108 bp)。為了證實(shí)這一假設(shè)，本研究分別構(gòu)建了啟動(dòng)子P1和P2與無啟動(dòng)子gusA基因的融合報(bào)告質(zhì)粒pL6PlgusA和pL6P2gusA，并檢測它們?cè)谝吧途?004中的GUS活性，結(jié)果表明，P1和P2均有啟動(dòng)子活性；進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明P1和P2的表達(dá)

3、均不受鋅離子的影響。為了確定P1和P2的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，我們進(jìn)行了5'-RACE實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明在ATG上游23 bp處的A堿基是P1的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，但是在我們所用的實(shí)驗(yàn)條件下沒有檢測到P2的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。 由于GUS活性結(jié)果表明P1和P2都具有啟動(dòng)子活性，因此我們推測zur既可以從ATG起始也可以從GTG起始翻譯，分別編碼兩種Zur蛋白即ZurL(從ATG起始)和ZurS(從GTG起始)。為了證實(shí)這一點(diǎn)，我們分別構(gòu)建了帶有翻譯起始

4、密碼子ATG→ATA和GTG→GTA點(diǎn)突變的zur基因的質(zhì)粒pL6zurATG和pL6zurGTG并分別導(dǎo)入zur的缺失突變體中，然后對(duì)點(diǎn)突變互補(bǔ)菌進(jìn)行鋅敏感性、EPS產(chǎn)量以及致病性進(jìn)行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，將GTG點(diǎn)突變后(只能合成ZurL蛋白)，重組質(zhì)粒pL6zurATG可以互補(bǔ)zur突變體的鋅敏感、致病力和EPS合成表型；而將ATG點(diǎn)突變后(只能合成ZurS蛋白)，重組質(zhì)粒pL6zurGTG可以互補(bǔ)突變體的致病力、EPS合成而不能互補(bǔ)其

5、鋅敏感表型，表明從ATG起始或從GTG起始編碼的蛋白均有生物學(xué)功能，且在功能有交叉也有差異：從ATG起始編碼的蛋白ZurL具有鋅平衡、EPS合成、致病調(diào)控功能，而從GTG起始編碼的蛋白ZurS，只有EPS合成、致病調(diào)控功能而沒有鋅平衡功能。為了進(jìn)一步鑒定ZurL和ZurS蛋白是否存在，我們?cè)贜YGB培養(yǎng)條件下對(duì)點(diǎn)突變互補(bǔ)菌株和缺失突變體菌株的Zur蛋白進(jìn)行了Western blotting檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在點(diǎn)突變體菌株的細(xì)胞提取物均能檢測

6、到一條雜交帶，而在缺失突變體菌株的細(xì)胞提取物中未能檢測到雜交帶，其結(jié)果表明在各自的點(diǎn)突變互補(bǔ)菌株中ZurL和ZurS是存在的，其結(jié)果與點(diǎn)突變體的表型檢測結(jié)果相符。但Western blotting檢測野生型菌株Xcc 8004的細(xì)胞提取物時(shí)，未能檢測到兩條雜交帶。 以上這些結(jié)果證明，(1)除了ATG前面的啟動(dòng)子(P1)外，zur基因讀碼框內(nèi)GTG上游-108 bp區(qū)域(P2)具有啟動(dòng)子活性；(2)從ATG起始編碼的蛋白ZurL具