十字花科黑腐病菌轉(zhuǎn)錄后全局調(diào)控蛋白RsmAXcc調(diào)控生物被膜形成的分子機(jī)制研究.pdf

1、RsmA(Repressor of Secondary Metabolism)/CsrA(Carbon Storage Regulator)蛋白是一類RNA結(jié)合蛋白，通過與靶標(biāo)基因mRNA結(jié)合影響基因的翻譯。RsmA是一個(gè)全局性的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，參與調(diào)控多種不相關(guān)連的代謝途徑如碳代謝、運(yùn)動性、生物被膜的形成、毒性因子的產(chǎn)生、致病性、細(xì)菌群體感應(yīng)和氧化應(yīng)激等。本實(shí)驗(yàn)室的研究發(fā)現(xiàn)，十字花科黑腐病菌（Xanthomonas campestri

2、spv.campestris，簡稱Xcc）rsmAXcc的缺失導(dǎo)致細(xì)胞聚集性增強(qiáng)、胞外多糖（Exopolysaccharide，EPS）產(chǎn)量下降及致病力降低。這說明，RsmAXcc在生物被膜形成、EPS產(chǎn)生和致病過程中起重要作用，但作用機(jī)理還不清楚。本研究主要探討RsmAXcc調(diào)控生物被膜形成的分子機(jī)制。
　　環(huán)鳥苷二磷酸(cyclic diguanylate，c-di-GMP)是細(xì)菌中存在的第二信使分子。一般而言，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)c-d

3、i-GMP濃度高時(shí)，細(xì)菌趨于靜止發(fā)生聚集，有利于生物被膜形成;而濃度較低時(shí)，有利于運(yùn)動性，細(xì)菌浮游生長。c-di-GMP的合成和降解分別由鳥苷酸環(huán)化酶(DGC)和磷酸二脂酶(PDE)控制，DGC的活性由GGDEF結(jié)構(gòu)域決定，而PDE活性由EAL及HD-GYP結(jié)構(gòu)域決定。Xcc8004全基因組注釋37個(gè)編碼GGDEF/EAL/HD-GYP結(jié)構(gòu)域蛋白的基因。本研究發(fā)現(xiàn)，rsmAXcc缺失突變導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)c-di-GMP含量顯著升高;凝膠阻滯(

4、EMSA)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，RsmAXcc可與XC1803、XC1824、XC2228、XC2715和XC28665個(gè)基因mRNA的5'UTR結(jié)合，其中XC1803、XC2715和XC2866三個(gè)基因編碼GGDEF結(jié)構(gòu)域蛋白，XC1824和XC2228兩個(gè)基因編碼EAL結(jié)構(gòu)域蛋白。RsmAXcc抑制XC1803、XC2715和XC2866翻譯水平的表達(dá)，在rsmAXcc缺失突變體的背景下缺失突變這三個(gè)基因?qū)е录?xì)菌由聚集生長轉(zhuǎn)換成浮游生長。X

5、C1824和XC2228兩個(gè)基因在Xcc8004和rsmAXcc缺失突變體中翻譯水平的表達(dá)差異不明顯，在rsmAXcc缺失突變體的背景下缺失突變這兩個(gè)基因，不影響細(xì)菌的聚集生長。這些結(jié)果說明，RsmAXc通過抑制直接靶標(biāo)基基因XC1803、XC2715和XC2866（編碼c-di-GMP合成酶）的表達(dá)，負(fù)調(diào)控Xcc細(xì)胞內(nèi)c-di-GMP水平，因此抑制生物被膜的形成。
　　manA是編碼一個(gè)能驅(qū)散細(xì)胞聚集體的酶(內(nèi)切β-1，4-甘露

6、糖酶(endo-β-1，4-mannanase)的基因，Xag-type EPS是生物被膜形成必須的，Clp為c-di-GMP的受體蛋白。rsmAXcc和clp Xcc缺失均導(dǎo)致manAXcc的轉(zhuǎn)錄水平顯著下降，xagAXcc轉(zhuǎn)錄水平顯著升高;Clp可與manAXcc和xagAXcc啟動子區(qū)結(jié)合，然而這種結(jié)合受c-di-GMP的抑制。因此我們認(rèn)為RsmAXcc通過促進(jìn)manAXcc的表達(dá)，抑制xagA和xagB的表達(dá)，抑制XCC生物被膜

7、的形成。
　　XCC產(chǎn)生至少兩種EPS，一種是由gum基因簇編碼的的黃原膠，另一種是xag基因簇編碼的xag-type EPS。ManA是一個(gè)能驅(qū)散細(xì)胞聚集體的蛋白，但是這種酶對于黃原膠沒有活性。rsmAXcc缺失突變體背景下過量表達(dá)manAXcc導(dǎo)致細(xì)菌發(fā)生聚集和EPS產(chǎn)量降低(42.36％)。因此，我們推測ManA可能通過降解xag-type EPS來解散生物被膜;此外，rsmAXcc缺失導(dǎo)致編碼黃原膠的gumB基因轉(zhuǎn)錄水平顯