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文檔簡介
1、Csr(Carbon Storage Regulator)/Rsm(Repressor of Secondary Metabolism)全局調(diào)控系統(tǒng)是一個由CsrA/RsmA蛋白和CsrB/RsmB,CsrC/RsmC等非編碼RNA(noncoding RNA,也稱small RNA)以及受CsrA/RsmA蛋白直接調(diào)控的mRNA組成的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控系統(tǒng)。該系統(tǒng)廣泛分布在各種細(xì)菌中,在細(xì)菌的碳代謝、次生代謝、運(yùn)動性、生物膜形成以及一些病原菌
2、的致病過程中發(fā)揮非常重要的作用。其調(diào)控機(jī)制在大腸桿菌(Escherichia coli)中研究得比較透徹。CsrA/RsmA蛋白是一類RNA結(jié)合蛋白,也是一個轉(zhuǎn)錄后調(diào)控子,它通過與靶標(biāo)基因mRNA的特異性結(jié)合影響基因的翻譯,同時它還是一個全局調(diào)控子,它參與各種與致病相關(guān)的許多細(xì)胞過程。在十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pathvar campestris,簡稱Xcc)中,CsrA/RsmA稱為RsmAxc
3、。小RNA是轉(zhuǎn)錄后全局調(diào)控的主要參與者,它通過與CsrA/RsmA的結(jié)合調(diào)節(jié)CsrA/RsmA的活性。
目前,已經(jīng)證實(shí)了在十字花科黑腐病菌中RsmAxc參與包括致病在內(nèi)的多種細(xì)胞過程,但Xcc中Rsm全局調(diào)控系統(tǒng)的另兩個重要組分——小RNA和mRNA——尚不清楚,為了深入了解RsmAxcc的作用機(jī)制,必須在Xcc中分離鑒定出與RsmAxc相互作用的小RNA和mRNA。
本研究先采用共純化法鑒定Xcc8004中
4、與RsmAxc互作的小RNA和mRNA。在采取共純化方法獲取靶標(biāo)的時候,我們構(gòu)建出了能過量表達(dá)6×His RsmAxcc蛋白的黃單胞菌菌株。為了證明表達(dá)的蛋白具有生物學(xué)活性,我們將表達(dá)蛋白的融和質(zhì)粒導(dǎo)入到rsmAxc缺失突變體菌株DM2506中,通過表型檢測分析,我們發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒的導(dǎo)入使得DM2506缺失的表型得到回補(bǔ)。這說明我們說獲得的6×His RsmAxc蛋白是有生物學(xué)活性的蛋白,可以用于下游的靶標(biāo)鑒定實(shí)驗(yàn)中。在本實(shí)驗(yàn)中,我們共得到7
5、68個克隆,從中挑選出180個送測序公司測序,測序后得到168條序列,經(jīng)序列比對后發(fā)現(xiàn)有15條序列能與Xcc 8004全基因組比對上,其中有5條是編碼23S核糖體RNA的基因,有10條是編碼tRNA的基因。結(jié)果表明,通過該方法,我們沒有鑒定出Rsm全局調(diào)控系統(tǒng)中的sRNA和mRNA。
另外,本研究還采用了靶標(biāo)預(yù)測的方法鑒定RsmAxc的直接作用靶標(biāo)。在十字花科黑腐病菌Xcc8004中,RsmAxc蛋白在轉(zhuǎn)錄后水平上直接調(diào)控
6、著很多編碼含有GGDEF/EAL結(jié)構(gòu)域蛋白的基因?;谶@一猜想,我們挑選出6個編碼含有GGDEF/EAL結(jié)構(gòu)域蛋白的基因:XC_0831、XC_1036、XC_1383、XC_1411、XC_2228、XC_2324作為受RsmAxc直接調(diào)控的候選靶標(biāo)。經(jīng)過電泳遷移率變動實(shí)驗(yàn)(electrophoresis mobility shif assay, EMSA),我們初步確定出基因XC_2228可能在轉(zhuǎn)錄后水平上受RsmAxc蛋白的直接調(diào)
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