十字花科黑腐病菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)效應(yīng)物基因的篩選和鑒定.pdf

1、十字花科黑腐病(Xanthomonascampestrispv.campestris，Xcc)是一種能在全球范圍內(nèi)引起所有十字花科植物黑腐病的重要病原細(xì)菌。在革蘭氏陰性細(xì)菌中，存在六種主要的蛋白分泌系統(tǒng)參與大分子物質(zhì)的分泌。其中Ⅳ型分泌系統(tǒng)(T4SS)對(duì)多種的動(dòng)物及人體病原細(xì)菌的致病性起著重要的作用，而且在植物病原細(xì)菌根癌農(nóng)桿菌的致病過程中扮演重要角色。在黃單胞菌屬中，Xac有12個(gè)基因編碼的蛋白與VirD4(Ⅳ型分泌系統(tǒng)ATPase)

2、互作。基因組注釋表明，Xcc8004含有編碼T4SS的基因，其中10個(gè)基因(XC1630-XC1639)成簇存在。而且XC1630-XC1639的Tn5gusA5突變體的GUS活性平板檢測(cè)顯示，這10個(gè)基因在MMX培養(yǎng)基上明顯比在NYGA培養(yǎng)基上表達(dá)強(qiáng)烈，表明T4SS是受信號(hào)誘導(dǎo)的。本研究旨在篩選和鑒定Ⅳ型分泌系統(tǒng)效應(yīng)物，為闡明該系統(tǒng)的生理功能，作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　 首先以三個(gè)Xcc8004Ⅳ型分泌系統(tǒng)裝置蛋白基因XC163

3、2、XC1633和XC1637的Tn5gusA5突變體為報(bào)告系統(tǒng)，通過測(cè)定GUS的方法，檢測(cè)了常用的六種培養(yǎng)基，結(jié)果顯示XCM誘導(dǎo)效果最好。然后以XCM為基礎(chǔ)，用多種常用碳源，氨基酸和TCA循環(huán)成分替換琥珀酸，結(jié)果沒有發(fā)現(xiàn)更好的替代物。在XCM不同pH條件下進(jìn)行GUS活性檢測(cè)，顯示pH7.0較好。此外，能誘導(dǎo)農(nóng)桿菌Vir基因活化的乙酰丁香酮經(jīng)檢測(cè)對(duì)Xcc的T4SS無(wú)誘導(dǎo)效果。因此選定了XCMpH7.0作為誘導(dǎo)T4SS的培養(yǎng)基。
　

4、　 其次在Xcc8004里搜尋與Xac的12個(gè)基因同源的基因，并從中挑選了4個(gè)：XC0066、XC2288、XC3660和XC4282作為研究對(duì)象。通過生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)這4個(gè)基因編碼的蛋白C端含有與Xac里報(bào)道相似的保守序列（GLxRIDHV和GxxDPAHxRAHV，x為任意殘基），而且也都存在富含谷氨酰胺的尾巴。PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因啟動(dòng)子加ORF去掉終止密碼子片段，克隆到報(bào)告質(zhì)粒pLGUS上，將獲得的重組質(zhì)粒三親分別導(dǎo)入到Xcc