十字花科黑腐病菌avrXccE1的寄主靶標(biāo)基因的鑒定.pdf

1、十字花科黑腐病菌(Xanthomonascampestrispv.campestris，簡稱Xcc)，是一種能在世界范圍內(nèi)引起十字花科植物產(chǎn)生黑腐病的革蘭氏陰性細(xì)菌。研究表明，該菌的無毒基因決定了病菌與寄主植物的相互作用結(jié)果。目前己從Xcc8004菌株中預(yù)測了9個(gè)無毒基因，其中4個(gè)已被實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)室前期的研究結(jié)果表明，含有無毒基因avrXccE1的Xcc8004對(duì)中白83的致病力很低，但是該基因的突變體對(duì)中白83的致病力顯著提高，實(shí)

2、驗(yàn)證明avrXccE1為無毒基因。生物信息學(xué)分析表明，無毒基因avrXccE1演繹的蛋白質(zhì)不具有核定向信號(hào)和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，具有胞質(zhì)蛋白的特征。為了鑒定該基因?qū)?yīng)的寄主靶標(biāo)基因，本研究采用蛋白-蛋白相互作用的研究策略，首先通過酵母雙雜交(YeastTwo-Hybrid，YTH)的方法用誘餌從寄主的被侵染cDNA文庫中調(diào)取候選互作基因，再用免疫共沉淀技術(shù)確認(rèn)真實(shí)的互作基因。
　　 本研究的主要研究結(jié)果：(1)通SMART方法，建

3、立了cDNA文庫，文庫轉(zhuǎn)化率為2.71×106/1μgpGADT7-Rec，重組率為86.4％；(2)將無毒基因avrXccE1構(gòu)建到雙雜交的BD載體pGBKT7上作為誘餌，對(duì)誘餌進(jìn)行自激活和毒性等相關(guān)實(shí)驗(yàn)均達(dá)到了酵母雙雜的后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求后。用誘餌來篩選構(gòu)建的中白83cDNA文庫。將雜交液先在SD/-Ade-His-Leu-Trp板上篩選，然后在SD/-Ade-His-Leu-Trp-X-α-Gal板上進(jìn)行兩次復(fù)篩，挑取陽性克隆，對(duì)雙鏈c

4、DNA進(jìn)行序列分析，并對(duì)NCBIGenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BlastX。初步從白菜中鑒定出4蛋白個(gè)與AvrXccE1相互作用，分別為泛素共軛連接酶11、硫醇轉(zhuǎn)甲基酶、磷酸活化酶、幾丁質(zhì)酶；(3)在已有的3’端的基礎(chǔ)上，對(duì)泛素共軛連接酶11基因(ubiquitin-conjuncatingligase11)進(jìn)行5'RACE(rapidamplificationofcDNAends)實(shí)驗(yàn)獲取該基因的5’端序列，從而得到了全長序列，全長為447