十字花科黑腐病菌小RNA直接靶標(biāo)鑒定.pdf

1、細(xì)菌小RNA(Small RNA，sRNA)是一類長(zhǎng)度為50-500 nt，通常不編碼蛋白但具有獨(dú)立功能的RNA分子。研究表明，細(xì)菌小RNA在重金屬離子代謝、環(huán)境應(yīng)答、群體感應(yīng)、生物膜的形成以及病原菌的致病性等方面發(fā)揮了重要的作用。細(xì)菌小RNA發(fā)揮功能的主要方式是通常與其靶標(biāo)mRNA以堿基配對(duì)的方式結(jié)合從而影響該mRNA的翻譯或穩(wěn)定性，因此在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶標(biāo)基因的表達(dá)。
　　十字花科黑腐病(Xanthomonas campest

2、ris pv.campestris，Xcc)是引起白菜、甘藍(lán)、蘿卜、油菜等重要十字花科作物黑腐病的病原菌，同時(shí)也是研究植物病原細(xì)菌致病機(jī)理的模式菌株之一。為了研究小RNA在Xcc中的作用，我們課題組幾年前就開展了小RNA鑒定和功能研究工作。到目前為止，我們已經(jīng)從Xcc中已鑒定了幾十個(gè)小RNA;此外，我們還采用缺失和過(guò)量表達(dá)方法對(duì)部分小RNA進(jìn)行了功能鑒定，但只有極少數(shù)的小RNA的生物學(xué)功能得到確定，而大部分小RNA的缺失和過(guò)量表達(dá)都沒有

3、觀察到表型變化，說(shuō)明大多數(shù)小RNA的功能是微效的，為此，本研究嘗試通過(guò)鑒定小RNA的直接靶標(biāo)來(lái)研究小RNA在細(xì)胞中的作用。我們的策略是，先用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)目的小RNA的直接靶標(biāo)，再用凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)(EMSA)進(jìn)行驗(yàn)證。
　　在已鑒定的幾十個(gè)Xcc小RNA中，我們選擇了4個(gè)(sRNA-Xcc1、 sRNA-Xcc2、sRNA-Xcc3和sRNA-Xcc4）表達(dá)豐度較高的小RNA作為我們的目的小RNA。我們首先用CopraRNA(Com

4、parativeprediction algorithm for small RNA target)軟件預(yù)測(cè)了這4個(gè)小RNA的直接靶標(biāo)。預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，在p值＜0.01且q值＜0.5的篩選條件下，sRNA-Xcc1、sRNA-Xcc2、sRNA-Xcc3和sRNA-Xcc4的靶標(biāo)基因分別為27個(gè)、2個(gè)、3個(gè)和35個(gè)。接著我們選擇了5個(gè)sRNA-Xcc1的預(yù)測(cè)靶標(biāo)(XC_2374、XC_1589、XC_0611、XC_1788、XC_072

5、1)，2個(gè)sRNA-Xcc2的預(yù)測(cè)靶標(biāo)(XC_4321、XC_1078)，3個(gè)sRNA-Xcc3的預(yù)測(cè)靶標(biāo)（XC_1548、XC_0725、XC_0690）和5個(gè)sRNA-Xcc4的預(yù)測(cè)靶標(biāo)(XC_0760、XC_3379、XC_3499、XC_3561、XC_2308)進(jìn)行EMSA實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。在進(jìn)行EMSA前，我們先用5'RACE(5'RapidAmplification of cDNA Ends)確定了候選靶標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。結(jié)果

6、發(fā)現(xiàn)只有XC_0725的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于預(yù)測(cè)的sRNA-Xcc3的結(jié)合區(qū)位點(diǎn)之前。另外，我們課題組之前已經(jīng)鑒定了XC4321的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，也位于預(yù)測(cè)的sRNA-Xcc2的結(jié)合位點(diǎn)之前。于是，我們對(duì)這兩個(gè)候選靶標(biāo)進(jìn)行EMSA驗(yàn)證。但是，EMSA結(jié)果顯示sRNA-Xcc2和sRNA-Xcc3均不能與對(duì)應(yīng)的預(yù)測(cè)靶標(biāo)RNA結(jié)合，說(shuō)明XC_4321不是sRNA-Xcc2的直接靶標(biāo)，XC_0725也不是sRNA-Xcc3的直接靶標(biāo)，或者它們與靶標(biāo)

7、的結(jié)合需要其它因子參與。
　　為了明確sRNA-Xcc2和sRNA-Xcc3是否調(diào)控候選靶標(biāo)基因的表達(dá)，我們用半定量RT-PCR檢測(cè)了sRNA-Xcc3的過(guò)量表達(dá)菌株中候選靶標(biāo)基因XC_0725的表達(dá)水平，以及sRNA-Xcc2的過(guò)量表達(dá)菌株和缺失突變體（將瑞萍博士之前構(gòu)建）中候選靶標(biāo)基因XC4321的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，XC4321在sRNA-Xcc2的過(guò)量表達(dá)菌株中的表達(dá)水平下降，在sRNA-Xcc2的缺失突變體中表達(dá)水平增加

8、，說(shuō)明sRNA-Xcc2負(fù)調(diào)控XC_4321的表達(dá)。sRNA-Xcc3的過(guò)量表達(dá)對(duì)XC_0725的表達(dá)水平?jīng)]有影響，說(shuō)明sRNA-Xcc3不參與XC_0725的表達(dá)調(diào)控。
　　本研究采用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)合凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)(EMSA)策略對(duì)4個(gè)Xcc小RNA的直接靶標(biāo)進(jìn)行了鑒定。雖然沒有鑒定到它們的直接靶標(biāo)，但發(fā)現(xiàn)sRNA-Xcc2負(fù)調(diào)控XC_4321的表達(dá)。由于EMSA結(jié)果顯示sRNA-Xcc2不能與XC_4321mRNA結(jié)合，我們推