熱休克蛋白70在Bcr-Abl細胞中抑制凋亡誘導因子的促凋亡作用.pdf

1、bcr/abl融合基因是慢性粒細胞白血?。–hronic myloid leukemia，CML）的分子標志，該基因表達具有組成型激活的酪氨酸激酶活性的Bcr/Abl融合蛋白，能夠異常活化PI3K-AKT、Ras和STAT5等一系列信號通路，使血細胞惡性增殖和凋亡受阻。除此以外，Bcr/Abl融合蛋白表達的細胞中還能檢測到熱休克蛋白70（Hsp-70）表達水平增高， Hsp-70作為細胞應激時的保護蛋白，近年來在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中受到

2、廣泛關注。Hsp-70可抑制Bax的線粒體定位，從而抑制線粒體通路的細胞凋亡；也可在線粒體下游抑制Apaf-1對caspase-9的募集作用，從而阻斷caspase凋亡通路的活化。此外，Hsp-70還能抑制非caspase凋亡通路。凋亡誘導因子（Apoptosis-inducing factor，AIF）是非caspase凋亡途徑的重要分子，生理條件下，AIF表達后依賴其N端1-120的線粒體定位信號（MLS）定位于線粒體，輔助呼吸鏈的

3、電子傳遞。凋亡發(fā)生時，AIF易位至細胞核中，誘發(fā)基因組DNA斷裂，促進細胞凋亡。在MEF細胞中，外源性過表達Hsp-70能夠阻斷AIF的細胞核定位，從而中和其促凋亡效應。AIF的150-226作為Hsp-70結合位點，介導 AIF與Hsp-70直接結合，這兩者之間的相互作用可能是Hsp-70影響AIF功能的主要途徑。
　　鑒于目前Hsp-70對AIF負性調節(jié)作用的研究基礎，和作者所研究的CML細胞中Hsp-70內(nèi)源性過表達，我們推

4、測，AIF及其所負責的非caspase凋亡通路在CML細胞中處于失活狀態(tài)，該狀態(tài)與CML的發(fā)病機制可能有關。為了證明這一推測，我們擬提出以下研究思路和方法：
　　首先，我們研究細胞在受到凋亡刺激時非caspase途徑的活化狀態(tài)以及AIF的功能。K562、32Dp210、Ba/F3p210以及各自的Bcr/Abl陰性對照細胞HL-60、32D、Ba/F3接受caspase抑制劑Z-VAD-FMK預處理阻斷caspase通路后，采用化

5、療藥物Vp-16誘導凋亡。采用FCM定量分析細胞凋亡，以驗證非caspase通路在各細胞中的活化能力。通過western blotting和IFT方法檢測內(nèi)源性AIF的亞細胞定位。同時，在K562細胞中表達外源性攜帶HA標簽的AIF突變體，該突變體缺失1-120氨基酸殘基的線粒體定位序列（dMLS-AIF），能夠靶向細胞核并起始凋亡。通過western blotting和IFT檢測外源性AIF的亞細胞定位，流式細胞術和瑞氏染色檢測細胞凋

6、亡。
　　其次，我們研究Bcr/Abl細胞Hsp-70的表達及其對AIF的影響。采用western blotting比較三株Bcr/Abl細胞、臨床CML病人骨髓細胞以及相應的Bcr/Abl陰性對照細胞中的Hsp-70表達。通過酪氨酸酶抑制劑伊馬替尼（IM）處理細胞抑制Bcr/Abl蛋白激酶活性后檢測Hsp-70的表達變化以及其轉錄因子Hsf-1的活化水平。為證明Hsp-70的水平影響AIF的定位，我們通過siRNA靶向沉默Hsp

7、-70，采用CCK-8和FCM檢測細胞增殖、周期及凋亡。隨后在Vp-16誘導下，通過western blotting和IFT檢測AIF的亞細胞定位，并通過FCM和TEM方法檢測caspase途徑被抑制后細胞的凋亡。
　　最后，我們研究Hsp-70抑制AIF促凋亡功能的機制。通過co-IP檢測Bcr/Abl細胞在細胞凋亡時過表達的Hsp-70與釋放的AIF的結合，以及K562細胞中Hsp-70與外源性HA標記的AIF突變體(dMLS

8、-AIF)的結合。并通過pull-down檢測不同細胞胞漿蛋白中Hsp-70與原核表達的AIF(HIS-AIF)蛋白的結合，以證明Hsp-70結合AIF的能力與其表達水平相關。為了證明AIF與過表達的Hsp-70結合是其入核受阻的原因，我們構建了缺失Hsp-70結合域的AIF突變體（dHBD-AIF）以破壞兩者之間的相互作用，腺病毒介導在K562細胞中表達，采用co-IP驗證其不能與Hsp-70結合，western blotting和I

9、FT檢測其亞細胞定位，最后通過FCM以及TEM分析dHBD-AIF誘導細胞凋亡的能力。
　　研究結果如下：
　　首先，Bcr/Abl細胞接受caspase抑制預處理后，Vp-16誘導的細胞凋亡完全受到抑制，而對照組細胞接受caspase抑制預處理后，凋亡率雖然下降，但仍明顯高于空白對照組。說明在Bcr/Abl細胞中，非caspase通路處于失活狀態(tài)。AIF是非caspase通路的重要分子，Bcr/Abl細胞中，Vp-16未能

10、誘導AIF入核：IFT核western blotting結果均顯示，AIF主要定位于細胞漿中，而Bcr/Abl陰性對照細胞中，AIF則明顯在細胞核中聚集。同時，缺失線粒體定位信號的AIF突變體（dMLS-AIF）也主要在K562細胞胞漿中表達。
　　其次，在K562、32D p210和Ba/F3p210三株細胞中，Hsp-70的水平是其Bcr/Abl陰性對照細胞HL-60、32D和Ba/F3的4-6倍；與正常人相比，CML病人骨髓

11、細胞Hsp-70上調可高達上百倍。上調的Hsp-70與Bcr/Abl蛋白有關，IM處理可通過抑制Hsf-1活性下調Hsp-70的水平，且表現(xiàn)出時間與濃度的依賴性。siRNA抑制Hsp-70后，結果顯示，細胞的生物學特征的改變與Hsp-70沉默效果相關，Hsp-70的沉默效果達到80％時，細胞周期受抑，凋亡增加；沉默效果達到60%時，僅細胞增殖受到影響，未有明顯的凋亡發(fā)生；10-20%沉默效果未能引起明顯生物學行為改變。Hsp-70沉默亦

12、可增加Bcr/Abl細胞對Vp-16的敏感性：Hsp-70沉默組的細胞在Vp-16作用下凋亡率明顯高于陰性對照組，Hsp-70沉默后，Vp-16能夠成功誘導內(nèi)源AIF以及外源dMLS-AIF入核。
　　最后，與對照組相比，Bcr/Abl細胞中高表達的Hsp-70能夠結合凋亡誘導時釋放的AIF，K562細胞中外源表達的dMLS-AIF亦可與Hsp-70結合。因不同細胞中Hsp-70表達量的差異，所結合的AIF也不同，與K562、32

13、D p210細胞的胞漿蛋白共孵育的His-AIF蛋白主要呈結合狀態(tài)，而與HL-60、32D胞漿蛋白共孵育后，His-AIF蛋白主要存在于穿梭液中。同時，外源表達dHBD-AIF能夠破壞與Hsp-70的結合，dHBD-AIF定位于胞核中，并誘導細胞凋亡，在形態(tài)學上可見細胞的凋亡發(fā)生在染色質邊集化的早期階段。
　　綜上所述，Bcr/Abl細胞異常表達的Hsp-70通過結合AIF抑制非caspase凋亡通路的活化，下調Hsp-70可以抑