轉(zhuǎn)galE和lgtC基因煙草糖組分變化的初步研究.pdf

1、來自大腸桿菌的galE基因，編碼UDP-galactose-4-epimerase(EC 5.1.3.2)，該酶在正常的代謝途徑中催化由UDP.葡萄糖向UDP-半乳糖的可逆轉(zhuǎn)換。來自奈瑟氏腦膜炎球菌的lgtC基因，編碼α-1，4-galactosyltransferase(EC 2.4.1.44)，該酶催化半乳糖殘基從供體分子轉(zhuǎn)移到受體分子上。本工作利用分別轉(zhuǎn)galE基因和lgtC基因的煙草植株研究細(xì)胞糖組分的變化，探求galE基因和l

2、gtC基因?qū)D(zhuǎn)基因植株代謝和生長發(fā)育的影響。 為了準(zhǔn)確測定轉(zhuǎn)基因煙草葉片的可溶性總糖組成和含量，本工作利用薄層層析方法分離和鑒定轉(zhuǎn)基因植株的各種糖分，同時采用高效液相色譜分離和示差折光檢測器測定技術(shù)定量葉片提取液中的蔗糖、葡萄糖和果糖含量，采用反向高效液相色譜分離和光電二極管陣列檢測器測定UDP-葡萄糖和UDP-半乳糖的含量。 轉(zhuǎn)galE基因煙草植株糖分測定以及galE酶活性分析本工作首先用RT-PCR方法篩選出galE

3、基因高效表達的煙草轉(zhuǎn)基因株系，然后對這些株系進行可溶性總糖、單糖和二糖以及核苷糖測定。在煙草酶提取液中加入底UDP-葡萄糖后，反應(yīng)液中出現(xiàn)產(chǎn)物UDP-半乳糖，即存在galE催化的反應(yīng)。測定轉(zhuǎn)基因植株的galE在不同條件下的酶活性，得出該酶在pH7-9之間具有活力，最適pH為7.5-8，最適酶反應(yīng)溫度約為20℃。轉(zhuǎn)正義基因株系UDP-半乳糖的生成量是野生型對照和轉(zhuǎn)反義基因株系的1.5-1.6倍。 轉(zhuǎn)基因煙草植株的糖分分析顯示，轉(zhuǎn)正

4、義基因的株系E+41和E+54的可溶性總糖含量較對照株系顯著提高，相應(yīng)的葡萄糖、果糖和蔗糖含量與對照相比均有不同程度的提高；E+41和E+54的UDP-半乳糖含量與野生型相比顯著提高，差異達到極顯著(P≤0.01)；UDP-葡萄糖含量與野生型相比也顯著提高。而轉(zhuǎn)反義基因株系E-23的UDP-糖、可溶性總糖以及其它糖分含量均與野生型植株無明顯差異。 轉(zhuǎn)基因植株生長發(fā)育觀察和光合作用測定表明，向煙草中轉(zhuǎn)入來源于原核生物的galE基因

5、影響植株的生長發(fā)育和光合作用。對煙草種子萌發(fā)過程和植株生長發(fā)育各個時期的形態(tài)特征進行觀察統(tǒng)計，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)正義基因植株在生長勢方面明顯優(yōu)于野生型對照植株。與野生型對照植株相比，轉(zhuǎn)正義基因植株幼苗具有更長的根系，在旺盛生長期具有更大的葉長、葉寬和葉面積，成熟期具有更高的植株高度，而且開花期相對較早。轉(zhuǎn)正義基因植株的凈光合速率明顯高于野生型對照植株的。轉(zhuǎn)反義基因植株在長勢、開花期和凈光合速率上均與野生型無明顯差異。 轉(zhuǎn)lgtC基因煙

6、草糖分的分析本工作采用RT-PCR技術(shù)選擇出lgtC基因高效表達的轉(zhuǎn)基因煙草株系，然后進行糖分測定，研究原核生物lgtC基因的引入對煙草植株體內(nèi)糖組分及其含量的影響。 糖分分析顯示，轉(zhuǎn)正義基因的株系C+27和C+43的可溶性總糖含量較野生型對照株系顯著提高，其中葡萄糖、果糖和蔗糖含量與對照相比也有不同程度的提高；C+27和C+43的UDP-半乳糖和UDP-葡萄糖含量較野生型均顯著降低。而轉(zhuǎn)反義基因株系C-32的可溶性總糖含量及葡