scAAV9-VEGF-165對(duì)ALS轉(zhuǎn)基因小鼠的治療作用及其作用機(jī)制研究.pdf

1、肌萎縮側(cè)索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis，ALS)是一種中年起病的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，大部分患者在診斷后的3-5年內(nèi)死于呼吸衰竭。該病選擇性地?fù)p傷大腦皮層、腦干及脊髓的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，從而導(dǎo)致臨床表現(xiàn)為肌肉萎縮以及肌肉無(wú)力。盡管約90％為散發(fā)病例，銅/鋅超氧化物歧化酶1（Cu2+/Zn2+superoxide dismutase，SOD1）基因突變?nèi)允亲顬槭熘募易逍约∥s側(cè)索硬化的病因，并且攜帶人類(lèi)突變的S

2、OD1-G93A基因的小鼠已經(jīng)被普遍地應(yīng)用于肌萎縮側(cè)索硬化治療及病因探索上來(lái)。
　　血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）一直以來(lái)作為生理及病理情況下血管生成的重要因素而廣泛研究，近年來(lái)許多研究證實(shí)其對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存在確定的保護(hù)作用，其在ALS中的重要作用也引起了廣泛關(guān)注。許多不同的載體及給藥途徑被用于轉(zhuǎn)運(yùn) VEGF至中樞神經(jīng)系統(tǒng)。Azzouz等人應(yīng)用慢病毒作為載體通過(guò)肌肉

3、注射的方式將VEGF轉(zhuǎn)運(yùn)至神經(jīng)元，并發(fā)現(xiàn)該方法可以有效地延長(zhǎng)ALS鼠的生存期。也有研究通過(guò)側(cè)腦室注射(Intracerebroventricular，ICV)的方式將VEGF蛋白或者是以腺相關(guān)病毒血清4型(Adeno-associated virus4, AAV4)為載體的VEGF基因轉(zhuǎn)運(yùn)至中樞神經(jīng)系統(tǒng)。另外也有研究通過(guò)鞘內(nèi)注射的方式將過(guò)表達(dá)VEGF的神經(jīng)干細(xì)胞移植至SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠。這些不同的給藥方式均可以延長(zhǎng)ALS小鼠的

4、生存期。然而，我們希望進(jìn)一步提高VEGF的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，尋找更有效的給藥途徑和方式。已有研究表明以巨細(xì)胞病毒（cytomegalovirus，CMV）為啟動(dòng)子的AAV9載體于脊髓的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中表達(dá)最強(qiáng)，而鞘內(nèi)注射雖然為有創(chuàng)操作，但是其具有用量小，脫靶效應(yīng)小的優(yōu)點(diǎn)，因此本研究中我們構(gòu)建以CMV為啟動(dòng)子的AAV9載體通過(guò)鞘內(nèi)注射的方式來(lái)轉(zhuǎn)運(yùn)VEGF，從而提高其轉(zhuǎn)染效率，進(jìn)而觀察VEGF對(duì)ALS小鼠生存期的影響。
　　ALS的發(fā)病機(jī)制尚不清

5、楚，許多復(fù)雜的分子及細(xì)胞水平機(jī)制都可以導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性。盡管多數(shù)研究都將關(guān)注點(diǎn)放在了運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元損傷，近年來(lái)許多研究發(fā)現(xiàn)非神經(jīng)元細(xì)胞也參與其發(fā)病機(jī)理并影響疾病的病情進(jìn)展。這種非細(xì)胞自身的毒性對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的死亡至關(guān)重要。小膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的固有免疫細(xì)胞是加速疾病進(jìn)展的重要因素，并且在炎癥反應(yīng)過(guò)程中也發(fā)揮著重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn)選擇性地抑制ALS小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞中的重要的炎癥調(diào)控因子 NF-kB可以明顯的減少運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的死亡。而活

6、化的小膠質(zhì)細(xì)胞又可以根據(jù)刺激因子及周?chē)h(huán)境的不同分為經(jīng)典活化型（M1型）與選擇活化型（M2）兩種分型。在疾病早期，起到神經(jīng)保護(hù)作用的M2型小膠質(zhì)細(xì)胞為主，而隨著疾病進(jìn)展在疾病快速進(jìn)展期，由于許多細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor，TNF-α）、白介素-1（Interleukin-1，IL-1）、γ-干擾素（Interferon-γ，IFN-γ）等的產(chǎn)生，小膠質(zhì)細(xì)胞逐漸以促炎的M1型為主。
　　因此，

7、本研究在以往VEGF作用機(jī)制研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探索其對(duì)ALS小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞增生及神經(jīng)炎癥的作用，以求進(jìn)一步了解VEGF對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用機(jī)制。
　　第一部分：鞘內(nèi)注射scAAV9-VEGF-165對(duì)ALS小鼠生存期及行為學(xué)的影響
　　目的：
　　驗(yàn)證改良后的鞘內(nèi)注射方式是否可以在中樞神經(jīng)系統(tǒng)有效地表達(dá)目的基因；構(gòu)建以 CMV為啟動(dòng)子的攜帶 VEGF-165治療基因的scAAV9載體，并通過(guò)改良簡(jiǎn)化的鞘內(nèi)注射方式干預(yù)9

8、0天的雌性及雄性ALS小鼠，觀察ALS小鼠生存期及行為學(xué)的改變。
　　方法：
　　1.構(gòu)建以CMV為啟動(dòng)子的scAAV9-VEGF-165及scAAV9-GFP病毒載體，經(jīng)純化透析后，通過(guò)PCR技術(shù)驗(yàn)證病毒滴度。
　　2.我們選取美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室的SOD1G93A小鼠為動(dòng)物模型，并在恒定溫度、恒定濕度且無(wú)特殊病原菌的動(dòng)物房中飼養(yǎng)、繁殖。改良的簡(jiǎn)化鞘內(nèi)注射方式：小鼠經(jīng)水合氯醛麻醉后，用透氣紗布覆蓋小鼠頭部及軀干上

9、部，并用拇指及食指固定小鼠髂骨部位，減去腰部毛發(fā)暴露中線位置。酒精消毒皮膚后，用漢密爾頓微量注射器在髂骨中線部位以70-80°進(jìn)針，感受到脊柱骨面后將進(jìn)針角度減少至30°并嘗試滑入椎間隙（L5-6）。小鼠出現(xiàn)側(cè)向甩尾或是尾巴呈現(xiàn)“S”形可以作為進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下腔的標(biāo)記。
　　3.小鼠經(jīng)簡(jiǎn)化的鞘內(nèi)注射方式給予scAAV9-GFP（1 x109 vg/g）干預(yù)三周后，分別將小鼠用冰的4%多聚甲醛灌注取材或直接新鮮取材，通過(guò)免疫熒光及蛋白印

10、跡技術(shù)觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)及分布特點(diǎn)，驗(yàn)證改良的鞘內(nèi)注射方式是否可以有效的在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)目的基因蛋白。
　　4.采用簡(jiǎn)化的鞘內(nèi)注射方式分別干預(yù)90天雌性及雄性的ALS小鼠。將同窩的、體重相近的90天雌性及雄性的ALS小鼠隨機(jī)的分為兩組，通過(guò)簡(jiǎn)化的鞘內(nèi)注射方式按體重分別給予 scAAV9-VEGF-165及 scAAV9-GFP（1μl/g），每組各15只。觀察給藥組及對(duì)照組的生存期并記錄其體重，同時(shí)通過(guò)腳印分析、轉(zhuǎn)輪及神經(jīng)功

11、能評(píng)分來(lái)評(píng)估 ALS小鼠的運(yùn)動(dòng)功能，從而觀察VEGF對(duì)ALS小鼠的治療作用。
　　結(jié)果：
　　1.構(gòu)建的scAAV9-VEGF-165及scAAV9-GFP載體經(jīng)PCR檢測(cè)病毒滴度為1×1012 vg/ml；
　　2.鞘內(nèi)注射scAAV9-GFP三周后，免疫熒光結(jié)果顯示綠色熒光蛋白主要在脊髓前角表達(dá)，并可以與NeuN標(biāo)記的神經(jīng)元共定位。免疫印跡結(jié)果表明，通過(guò)我們改良后的簡(jiǎn)易的鞘內(nèi)注射方式給予scAAV9-GFP后，綠色

12、熒光蛋白可以在中樞神經(jīng)系統(tǒng)廣泛表達(dá)，包括脊髓、小腦、皮層，并且以脊髓分布為主；
　　3.經(jīng)scAAV9-VEGF-165鞘內(nèi)注射干預(yù)的雌性ALS小鼠較對(duì)照組生存期延長(zhǎng)13天(P﹤0.01)，雄性小鼠生存期延長(zhǎng)12天(P﹤0.01)，雌性、雄性之間的天數(shù)區(qū)別沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在早期，GFP對(duì)照組小鼠的體重相較于VEGF給藥組小鼠偏低，但是這種差別并沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，直到121天（雌鼠）和129天（雄鼠）時(shí)，GFP對(duì)照組小鼠的體重與 VE

13、GF-165給藥組小鼠的體重差異才存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。腳印分析表明在小鼠110天時(shí)，對(duì)照組表現(xiàn)出更明顯的步態(tài)異常以及步長(zhǎng)變短的情況。在轉(zhuǎn)輪實(shí)驗(yàn)中， VEGF-165給藥組雌、雄小鼠的表現(xiàn)均較對(duì)照組好。同時(shí)，給予VEGF-165后可以延緩小鼠神經(jīng)功能評(píng)分的降低。另外，我們通過(guò)對(duì)小鼠腓腸肌的HE染色發(fā)現(xiàn)，GFP對(duì)照組小鼠肌肉萎縮更加明顯，HE染色可見(jiàn)角型萎縮及核中心移位。
　　第二部分：鞘內(nèi)注射VEGF通過(guò)其抗凋亡作用保護(hù)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元

14、>　　目的：
　　觀察鞘內(nèi)注射scAAV9-VEGF-165后的ALS小鼠較對(duì)照組脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)目及形態(tài)的變化，并對(duì)其神經(jīng)保護(hù)機(jī)制進(jìn)行研究。
　　方法：
　　1.我們選取美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室的SOD1G93A小鼠為動(dòng)物模型，并在恒定溫度、恒定濕度且無(wú)特殊病原菌的動(dòng)物房中飼養(yǎng)、繁殖。隨機(jī)將6組90天ALS小鼠給予鞘內(nèi)注射scAAV9-VEGF-165及scAAV9-GFP，3周后分別將小鼠用冰的4%多聚甲醛灌注取材

15、（3組）或直接新鮮取材（3組）。
　　2.通過(guò)免疫組化染色計(jì)數(shù)VEGF-165給藥組及GFP對(duì)照組SMI-32陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，并觀察VEGF-165給藥組及GFP對(duì)照組運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元形態(tài)變化。
　　3.通過(guò)原位末端標(biāo)記法(Terminal deoxynucleotidyl transferase-media-ted dUTP end-labeling，TUNEL)檢測(cè)VEGF-165給藥組及GFP對(duì)照組小鼠腰髓細(xì)胞凋亡情況，并進(jìn)一步

16、通過(guò)免疫印跡技術(shù)檢測(cè)VEGF-165給藥組及GFP對(duì)照組小鼠PI3K/Akt信號(hào)通路的改變及抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax的水平變化。
　　結(jié)果：
　　1.免疫組化結(jié)果顯示110天取材的VEGF-165治療組小鼠的腰髓SMI-32陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較GFP對(duì)照組小鼠明顯保留(8.8±1.96個(gè)/層vs.6.2±1.3個(gè)/層，P﹤0.05)，且運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元形態(tài)更加完整；
　　2.TUNEL檢測(cè)結(jié)果表明VEGF-165治療組

17、小鼠腰髓TUNEL陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組明顯減少(24.8±8.2%vs.44.5±14.4%，P﹤0.05)；
　　3.給予scAAV9-VEGF-165鞘內(nèi)注射3周后，小鼠腰髓VEGF-165水平明顯升高約2倍，通過(guò)免疫印跡技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)VEGF-165治療組小鼠脊髓 PI3K/Akt信號(hào)通路激活， PI3K/Akt水平較對(duì)照組升高，且活化的caspase-9及 caspase-3水平降低(P﹤0.05)。同時(shí)，與GFP對(duì)照組相對(duì)

18、比， VEGF-165治療組小鼠的脊髓中抗凋亡蛋白Bcl-2水平升高而促凋亡蛋白Bax水平下降(P﹤0.05)。
　　第三部分：VEGF治療減少 ALS小鼠脊髓膠質(zhì)細(xì)胞增生并調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞分化
　　目的：
　　觀察鞘內(nèi)注射 scAAV9-VEGF-165后的ALS小鼠較對(duì)照組脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目及形態(tài)的變化，并探討 VEGF對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞分型及神經(jīng)炎癥的影響。
　　方法：
　　1.我們選取美國(guó)Ja

19、ckson實(shí)驗(yàn)室的SOD1G93A小鼠為動(dòng)物模型，并在恒定溫度、恒定濕度且無(wú)特殊病原菌的動(dòng)物房中飼養(yǎng)、繁殖。隨機(jī)將6組90天ALS小鼠給予鞘內(nèi)注射scAAV9-VEGF-165及scAAV9-GFP，3周后分別將小鼠用冰的4%多聚甲醛灌注取材（3組）或直接新鮮取材（3組）。
　　2.通過(guò)免疫組化染色計(jì)數(shù)VEGF-165給藥組及GFP對(duì)照組GFAP及Iba1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，并觀察VEGF-165給藥組及GFP對(duì)照組星形膠質(zhì)細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)

20、胞形態(tài)變化，另外通過(guò)免疫印跡技術(shù)觀察 VEGF治療組小鼠及對(duì)照組小鼠脊髓CD11b及GFAP水平的差異。
　　3.通過(guò)免疫熒光技術(shù)觀察VEGF治療組、GFP對(duì)照組ALS小鼠及陰性對(duì)照鼠脊髓CD68的表達(dá)及其與Iba1共定位的情況，另外通過(guò)PCR技術(shù)分析研究 VEGF治療組、GFP對(duì)照組 ALS小鼠及陰性對(duì)照鼠脊髓中CD68、TNF-α、IL-1β、Arginase-1以及Ym-1mRNA水平的差異，并通過(guò)免疫印跡技術(shù)觀察VEGF治

21、療組、GFP對(duì)照組ALS小鼠及陰性對(duì)照鼠脊髓中CD68、TNF-α、Arginase-1及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（Transforming growth factor beta，TGF-β）蛋白水平的差異。
　　結(jié)果：
　　1.免疫組化結(jié)果顯示110天取材的GFP對(duì)照組小鼠的腰髓 GFAP(311±46個(gè)/層 vs.163±17.61個(gè)/層，P﹤0.05)及Iba1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(383±19.15個(gè)/層 vs.218.3±28.02個(gè)/

22、層，P﹤0.05)較VEGF治療組小鼠增生明顯，且膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)更為肥大。免疫印跡結(jié)果表明 VEGF治療組小鼠較GFP對(duì)照組小鼠脊髓中CD11b及GFAP蛋白水平明顯降低(P﹤0.05)，與免疫組化結(jié)果一致；
　　2.免疫熒光結(jié)果表明陰性小鼠脊髓 CD68陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)很少，而 GFP對(duì)照組ALS小鼠CD68陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增多，而給予VEGF治療后CD68陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少，同時(shí) CD68陽(yáng)性細(xì)胞可以與 Iba1標(biāo)記的小膠質(zhì)細(xì)胞共標(biāo)記；

23、
　　3.PCR結(jié)果表明給予VEGF治療后的ALS小鼠脊髓中M1型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物（CD68、TNF-α、IL-1β）的水平較對(duì)照組降低(P﹤0.05)，而M2型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物（Arginase-1及Ym-1）的水平有所升高(P﹤0.05)；
　　4.免疫印跡結(jié)果顯示與PCR結(jié)果一致，即VEGF治療后可以提高ALS小鼠脊髓中Arginase-1的水平，并減少CD68、TNF-α蛋白的表達(dá)，同時(shí)可以使TGF-β水平升高，而T

24、GF-β可以促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為M2型。
　　結(jié)論：
　　1.本研究采用了改良后簡(jiǎn)化的鞘內(nèi)注射手法干預(yù)小鼠，并構(gòu)建了以CMV為啟動(dòng)子的scAAV9病毒載體，通過(guò)該方法給予scAAV9-GFP后，發(fā)現(xiàn)目的蛋白可以在中樞神經(jīng)系統(tǒng)廣泛表達(dá)，并主要表達(dá)于脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，從而證實(shí)該方法的可操作性，為下一步進(jìn)行VEGF干預(yù)治療提供依據(jù)。
　　2.與以往研究結(jié)論一致，我們采用改良后的鞘內(nèi)注射方式給予ALS小鼠scAAV9-VEG