hMSCs鞘內(nèi)移植治療SOD1轉(zhuǎn)基因小鼠及其作用機制的研究.pdf

1、研究背景：肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)是一種進行性，致死的神經(jīng)變性病，其中5-10％的病例為家族性肌萎縮側(cè)索硬化(fALS)。1993年Rosen在fALS家族中發(fā)現(xiàn)了SOD1基因的錯義突變是ALS研究中的一個重要里程碑，隨后Gurney建立了突變SOD1的轉(zhuǎn)基因小鼠模型。目前ALS尚缺乏有效的藥物治療，而干細胞移植可能是未來治愈ALS的希望。雖然干細胞移植在SOD1轉(zhuǎn)基因小鼠的研究中已經(jīng)取得了一些令人鼓舞的結(jié)果，但是還有一些關(guān)鍵問題需要解

2、決。首先，移植細胞的選擇還需要進一步研究。倫理問題限制了胚胎干細胞的應(yīng)用。來源問題是神經(jīng)干細胞最大的挑戰(zhàn)。而由于容易獲取，血液來源的干細胞包括臍帶血干細胞和骨髓干細胞等成為治療人類疾病較合適的選擇。本研究中我們選擇了人骨髓間充質(zhì)干細胞(human mesenchymal stem cells，hMSCs)。在骨髓中作為營養(yǎng)細胞來支持造血干細胞的功能顯示MSCs發(fā)揮神經(jīng)保護作用的潛能。MSCs很容易從自體骨髓抽取物中安全大量獲取，而且自體

3、移植可以繞過免疫排斥問題。這些優(yōu)勢顯示MSCs臨床應(yīng)用的巨大前景。第二，細胞移植的治療機制還不清楚。功能性替代丟失的神經(jīng)元非常困難，因此干細胞更可能是發(fā)揮了神經(jīng)保護作用。研究顯示活化的小膠質(zhì)細胞及其產(chǎn)生的致炎細胞因子在SOD1小鼠疾病進展中起到重要作用。再者，應(yīng)用COX-2抑制劑已經(jīng)取得了令人鼓舞的結(jié)果，SOD1小鼠生存期能夠延長20％。這提示小膠質(zhì)細胞是一個有效的治療靶點。然而小膠質(zhì)細胞的作用是復(fù)雜的，它們即能起到神經(jīng)保護作用，也可能

4、是有害的，最后的結(jié)果可能依賴于小膠質(zhì)細胞活化的強度以及與鄰近神經(jīng)元的相互作用。因此，抑制小膠質(zhì)細胞活化也可能是有害的，但關(guān)鍵的問題是什么樣的治療能夠操縱小膠質(zhì)細胞，最小化它的神經(jīng)毒性作用，最大化它對運動神經(jīng)元的保護作用?MSCs能夠產(chǎn)牛很多神經(jīng)營養(yǎng)因子和細胞因子，一個非常重要的觀察是環(huán)境能夠影響這些因子的分泌。那么MSCs是否能夠在炎癥環(huán)境中根據(jù)需要來抑制小膠質(zhì)細胞的活化?最后，理想的細胞移植途徑仍不確定。ALS為彌漫性的神經(jīng)變性病，因

5、此局部注射細胞在臨床上是不現(xiàn)實的。靜脈移植細胞是最常選擇的移植途徑，但只有很少的細胞能夠通過血腦屏障進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)實質(zhì)。而鞘內(nèi)注射是一種很有前景的移植途徑，移植到腦脊液中的細胞能夠繞過血腦屏障，可能會更容易遷移到病變的組織，但是研究結(jié)果還不一致。研究目的研究鞘內(nèi)移植hMSCs是否對SOD1轉(zhuǎn)基因小鼠有治療作用；研究移植到腦脊液中的hMSCs能否通過脊髓軟膜進入脊髓實質(zhì)，識別一種更有效的移植途徑；研究hMSCs是否能夠抑制小膠質(zhì)細胞的活

6、化和炎癥反應(yīng)；進一步探討MSCs抑制神經(jīng)炎癥的機制。 研究方法： 1體內(nèi) 1.1動物模型首先雌性C57BL／6J小鼠與雄性SJL／J小鼠雜交，子一代為B6SJL。然后用雌性B6SJL小鼠與雄性SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠交配，應(yīng)用PCR來鑒定子代鼠中SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠。雌性SOD1轉(zhuǎn)基因小鼠隨機分為：①hMSCs單次鞘內(nèi)移植組(n=15)，在12周齡的小鼠鞘內(nèi)移植hMSCs；②hMSCs多次鞘內(nèi)移植組(

7、n=25)，在12、14和16周齡的小鼠多次鞘內(nèi)移植hMSCs；③PBS對照組(n=24)。同窩出生的野生型小鼠作為正常對照組(n=16)。 1.2 hMSCs的培養(yǎng)和鑒定從健康志愿者的髂骨嵴抽取2-10ml的骨髓，F(xiàn)icoll梯度密度離心分離單核細胞。用流式細胞儀檢測P4 hMSCs表面抗原CD34、CD44、CD29和CD45。取4代的hMSCs進行移植，細胞懸液的密度為100，000個／μ 1PBS，在移植前后用0.4％臺

8、盼蘭檢測細胞活性。 1.3鞘內(nèi)移植小鼠用苯巴比妥麻醉，取俯臥位，頸部墊高使頭部俯屈大約30o。緩慢注射5 μl的細胞懸液或PBS到枕大池。所有動物在手術(shù)前3天和之后給予環(huán)孢素A進行免疫抑制。 1.4評估疾病進展從第10周開始，每周監(jiān)測小鼠疾病進展，包括臨床觀察、懸線試驗、轉(zhuǎn)棒試驗和稱重(單次移植組15只，多次移植組13只，PBS對照組12只，野生型對照組8只)。當(dāng)小鼠連續(xù)2周顯示運動缺損癥狀，回顧最早的時間即為臨床發(fā)作時

9、間。將小鼠身體翻轉(zhuǎn)為仰臥位后，30秒內(nèi)不能翻身為俯臥位的時間定義為死亡時間。 2體外試驗 取出生1-2天的C57小鼠大腦原代培養(yǎng)混合的膠質(zhì)細胞，應(yīng)用搖動的方法來分離小膠質(zhì)細胞。由于原代小膠質(zhì)細胞培養(yǎng)困難，除了免疫熒光染色外，其它實驗應(yīng)用永生化的小膠質(zhì)細胞系BV-2細胞。根據(jù)文獻和LPS刺激BV-2細胞產(chǎn)生NO的濃度關(guān)系研究，我們選擇1 μg／ml LPS刺激小膠質(zhì)細胞活化。為了進一步探討hMSCs抑制小膠質(zhì)細胞活化的機制

10、，應(yīng)用RT—PCR來分析hMSCs在活化的BV-2細胞條件培養(yǎng)基中神經(jīng)營養(yǎng)因子IGF-1、VEGF、BDNF、CTGF和TGF-α mRNA表達。 3統(tǒng)計分析存活資料應(yīng)用Kaplan-Meier和Mantel-Cox分析。其它的資料應(yīng)用單因素方差分析及Tukey事后檢驗分析。所有數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。 結(jié)果： 1 hMSCs多次鞘內(nèi)移植能夠延緩SOD1小鼠疾病進展首先我們通過臨床觀察、稱重和行為學(xué)試驗評估各組小鼠疾病進

11、展。與PBS對照組相比，在12周單次鞘內(nèi)移植hMSCs對SOD1小鼠的疾病進展沒有作用(此組資料不再顯示)，但在12、14和16周多次鞘內(nèi)移植hMSCs能夠延遲SOD1小鼠疾病發(fā)作7天(約5％，P<0.05)，延長存活期16天(約9％，P<0.01)。與PBS對照組相比，從21周開始hMSCs多次移植組小鼠運動功能明顯改善(P<0.05)，從22周起hMSCs多次移植能夠明顯減少SOD1小鼠體重丟失(P<0.05)。然后我們應(yīng)用尼氏染色

12、評估小鼠腰髓運動神經(jīng)元數(shù)目。與PBS對照組相比，18周時(發(fā)病前)hMSCs多次移植組運動神經(jīng)元數(shù)目沒有明顯差異(P>0.05)，21周(臨床發(fā)作)時hMSCs多次移植組運動神經(jīng)元(包括α和γ神經(jīng)元)丟失明顯減少(P<0.01)。 2鞘內(nèi)移植的hMSCs不能通過脊髓軟膜進入脊髓實質(zhì)為了檢測hMSCs在SOD1小鼠腰髓內(nèi)的分布，我們應(yīng)用入特異性抗HuNu抗體進行免疫熒光染色。第4代hMSCs種板24小時后進行免疫熒光染色，所有細胞

13、均為HuNu免疫染色陽性。但是在21周的hMSCs多次移植的小鼠腰髓，我們沒有探測至到HuNu免疫反應(yīng)陽性的細胞，提示鞘內(nèi)移植的hMSCs不能通過脊髓軟膜進入脊髓實質(zhì)。 3多次鞘內(nèi)移植hMSCs能抑制膠質(zhì)細胞的活化和炎癥反應(yīng)我們檢查了hMSCs多次移植組和PBS對照組小鼠18、21周時腰髓膠質(zhì)細胞的活化、p-p38MAPK和TNF—α水平。與PBS對照組相比，21周時抗CD11b和抗GFAP抗體的免疫熒光染色顯示hMSCs移植組

14、小鼠腰髓小膠質(zhì)細胞活化和星形膠質(zhì)細胞反應(yīng)明顯減輕；相一致的是，hMSCs移植組小鼠腰髓TNF—α和p—p38MAPK明顯減少(P<0.01)。 4在體外，hMSCs抑制小膠質(zhì)細胞活化為了證實鞘內(nèi)移植hMSCs減輕炎癥是由于減少了運動神經(jīng)元的死亡還是由于減輕了神經(jīng)炎癥從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用，我們在體外檢查了hMSCs對LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞活化的作用。加入LPS12小時后，大多數(shù)原代小膠質(zhì)細胞顯示外形增大，F(xiàn)4／80免疫反應(yīng)增強，

15、而對照組小膠質(zhì)細胞仍為圓形；相比之下，hMSCs混合共培養(yǎng)和transwell培養(yǎng)中的小膠質(zhì)細胞大多數(shù)沒有增大，而是保持靜息狀態(tài)的圓形，顯示沒有被充分活化。另外，與LPS對照組相比，hMSCs條件培養(yǎng)基對小膠質(zhì)細胞的活化沒有明顯作用。與小膠質(zhì)細胞形態(tài)學(xué)改變一致的是，在混合共培養(yǎng)和transwell培養(yǎng)時，hMSCs能夠減少BV-2細胞釋放NO、分泌TNF—α和p—p38MAPK蛋白的表達。MTT試驗顯示hMSCs共培養(yǎng)、transwel

16、l培養(yǎng)和hMSCs條件培養(yǎng)基培養(yǎng)對BV-2細胞活力沒有影響。 最近一些研究顯示神經(jīng)營養(yǎng)因子能夠減輕炎癥，為了理解hMSCs抑制小膠質(zhì)細胞活化的機制，我們檢查了在炎癥環(huán)境中hMSCs的神經(jīng)營養(yǎng)因子mRNA表達。與對照組hMSCs相比，在炎癥環(huán)境中中，hMSCs明顯增加神經(jīng)營養(yǎng)因子包括IGF-1、VEGF、BDNF、CTGF和TGF的mRNA表達(p<0.01)。 結(jié)論： 多次鞘內(nèi)移植hMSCs能夠延遲SOD1小鼠疾