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文檔簡(jiǎn)介
1、第一部分 ScAAV9-hIGF1逆軸突靶向轉(zhuǎn)染運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的理論和實(shí)踐
目的:研究發(fā)現(xiàn),AAV9可以通過(guò)外周給藥逆軸突靶向轉(zhuǎn)染腦和脊髓的神經(jīng)元,而且自身互補(bǔ)雙鏈AAV(scAAV)比傳統(tǒng)單鏈AAV轉(zhuǎn)染效率高,蛋白表達(dá)速度快。本部分首先來(lái)驗(yàn)證1×1012vg/ml的AAV9-GFP和s cAAV9-hIGF1病毒載體是否能通過(guò)肌肉注射逆軸突靶向轉(zhuǎn)染SOD1G93A A LS成年小鼠的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元,并實(shí)現(xiàn)蛋白的持續(xù)表達(dá),建立scAA
2、V9為載體、營(yíng)養(yǎng)因子為基礎(chǔ)的基因治療,為進(jìn)一步治療肌萎縮側(cè)索硬化提供可行的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
方法:
1隨機(jī)選取60天齡成年SOD1G93A ALS小鼠,給予雙側(cè)腓腸肌一次性注射AAV9-GFP病毒載體,10ul/肌,即1×1010vg/肌。三周后,麻醉處死動(dòng)物,冰凍切片,在熒光顯微鏡下直接觀察肌肉和脊髓的綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá)。
2選取60天齡成年SOD1G93AALS小鼠,隨機(jī)分為空白對(duì)照組(contro
3、l組,n=15)和,AAV9-GFP組給予一次性肌肉注射AAV9-GFP10ul/肌,即1×1010vg/肌,注射肌肉包括雙側(cè)的咬肌、肱二頭肌、肱三頭肌、肋間肌、腹肌、股二頭肌、股四頭肌、腓腸肌,n=15,每天觀察兩組動(dòng)物發(fā)病時(shí)間和生存期。用蛋白印跡技術(shù)方法檢測(cè)終末期兩組小鼠 GFP蛋白的表達(dá)。
3隨機(jī)選取60天齡成年SOD1G93A ALS小鼠,給予雙側(cè)腓腸肌一次性注射 scAAV9-hIGF1病毒載體,10ul/肌,即1×
4、1010vg/肌,n=3。三周后,麻醉,多聚甲醛灌注,取小鼠脊髓腰膨大組織,運(yùn)用免疫熒光技術(shù)在熒光顯微鏡下觀察腰髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元 scAAV9-hIGF1逆軸突靶向轉(zhuǎn)染神經(jīng)元及hIGF1蛋白的表達(dá)情況。
4隨機(jī)選取60天齡成年SOD1G93A ALS小鼠,給予雙側(cè)腓腸肌一次性注射scAAV9-hIGF1病毒載體,10ul/肌,即1×1010vg/肌。三周后,麻醉處死動(dòng)物,迅速取脊髓腰膨大組織,用ELISA技術(shù)檢測(cè)hIGF1蛋白
5、在小鼠腓腸肌和對(duì)應(yīng)腰髓的相對(duì)表達(dá)量。
結(jié)果:1一次性雙側(cè)腓腸肌注射AAV9-GFP,10μl/肌,三周后,冰凍切片,熒光顯微鏡下直接觀察,可見腓腸肌組織、神經(jīng)軸突和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元都有綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá);2 AAV9-GFP小鼠與空白對(duì)照組小鼠的發(fā)病時(shí)間和生存期無(wú)明顯差異,兩組發(fā)病時(shí)間中位數(shù)分別為96d、97d;生存期中位數(shù)均為120d,說(shuō)明AAV9-GFP干預(yù)不影響小鼠的發(fā)病時(shí)間和生存期,整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程未發(fā)現(xiàn) AAV9對(duì)小
6、鼠有明顯不良反應(yīng)。終末期小鼠麻醉后取腰髓組織,運(yùn)用蛋白印跡方法檢測(cè) GFP蛋白的表達(dá),發(fā)現(xiàn)終末期仍有GFP蛋白的表達(dá),說(shuō)明AAV9能夠使基因在體內(nèi)持續(xù)表達(dá)蛋白;3免疫熒光顯示scAAV9-hIGF1能逆軸突靶向轉(zhuǎn)染ALS成年小鼠的腰髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元,并表達(dá)hIGF1蛋白;4 ELISA檢測(cè)hIGF1蛋白在注射的腓腸肌及對(duì)應(yīng)腰段脊髓的表達(dá)量,腰段脊髓 hIGF1蛋白表達(dá)量為注射肌肉的35%,轉(zhuǎn)染效率約為26%。
第二部分肌肉注射sc
7、AAV9-hIGF1干預(yù)ALS小鼠模型的療效觀察
目的:我們用60d齡和90d齡的同窩拷貝數(shù)相同的肌萎縮側(cè)索硬化SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠為動(dòng)物模型,隨機(jī)分為 scAAV9-hIGF1干預(yù)組和AAV9-GFP對(duì)照組,給予一次性多部位肌肉注射,給藥劑量為每塊肌肉1×1010vg(10μl),觀察scAAV9-hIGF1是否對(duì)運(yùn)動(dòng)功能有改善作用,是否對(duì)肌肉組織、腰髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元有保護(hù)作用,能否減少星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的增生,最重
8、要的是否能夠推遲小鼠發(fā)病及延長(zhǎng)生存期。
方法:
1動(dòng)物分組:60天和90天齡的同窩SOD1G93A轉(zhuǎn)基因ALS小鼠,隨機(jī)一次性肌肉注射scAAV9-hIGF1和AAV9-GFP,60天和90天齡小鼠雌雄各15對(duì)。
2肌肉注射部位包括雙側(cè)的咬肌、肱二頭肌、肱三頭肌、肋間肌、腹肌、股二頭肌、股四頭肌、腓腸肌,scAAV9-hIGF1和AAV9-GFP的用藥量為10ul/肌。
3每周觀察并記錄小鼠的評(píng)分
9、,運(yùn)動(dòng)功能(轉(zhuǎn)輪時(shí)間),體重等變化,每天觀察并記錄小鼠的發(fā)病及終末時(shí)間。小鼠的發(fā)病時(shí)間定為當(dāng)天三次轉(zhuǎn)輪時(shí)間(恒速15轉(zhuǎn)/分)最長(zhǎng)時(shí)間不能達(dá)到180s,記為發(fā)??;小鼠終末時(shí)間為背臥位30s不能自行翻身。ALS小鼠110d齡時(shí)記錄小鼠的步長(zhǎng)和足跡。
4兩組ALS小鼠110d齡時(shí),麻醉后迅速取腓腸肌組織,冰凍切片,用HE,NADH,MGT等染色方法觀察ALS小鼠腓腸肌組織的病理變化。
5兩組ALS小鼠110d齡時(shí),麻醉后灌
10、注取材,取腰髓組織,震蕩切片用SMI32,GFAP,Iba1免疫組化染色觀察小鼠腰髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量的變化。
結(jié)果:1 ScAAV9-hIGF1干預(yù)組小鼠肌肉萎縮明顯減輕,后肢的外展較有力,步長(zhǎng)較AAV-GFP組小鼠明顯改善;2 ScAAV9-hIGF1干預(yù)小鼠(60天齡給藥)發(fā)病時(shí)間中位數(shù)雄雌分別延長(zhǎng)了24天(121d vs.97d),18天(118d vs.100d);生存期中位數(shù)雌雄分別延長(zhǎng)了29
11、天(149d vs.120d),24天(147d vs.123d)。ScAAV9-hIGF1干預(yù)小鼠(90天齡給藥)生存期中位數(shù)雌雄分別延長(zhǎng)了15天(138d vs.123d),14天(137d vs.123d);3無(wú)論是60天齡還是90天齡scAAV9-hIGF1干預(yù)的ALS小鼠在神經(jīng)功能評(píng)分,體重,運(yùn)動(dòng)功能方面都比AAV9-GFP對(duì)照組小鼠有明顯改善;4肌肉病理提示 AAV9-GFP對(duì)照組小鼠的肌纖維可見明顯的萎縮(HE染色),呈神
12、經(jīng)源性損傷(NADH染色),線粒體損傷較重(MGT染色);ScAAV9-hIGF1治療組小鼠肌肉萎縮改善,也有神經(jīng)源性損傷的表現(xiàn),線粒體損傷較輕;5免疫組織化學(xué)顯示 scAAV9-hIGF1干預(yù)小鼠與AAV9-GFP對(duì)照組小鼠相比,腰髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元(SMI32陽(yáng)性)數(shù)量減少明顯改善(P<0.05);星形膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP陽(yáng)性)和小膠質(zhì)細(xì)胞(Iba1陽(yáng)性)的免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示scAAV9-hIGF1能明顯減輕轉(zhuǎn)基因小鼠腰髓星形膠質(zhì)細(xì)胞
13、和小膠質(zhì)細(xì)胞增生的程度(P<0.05)。
第三部分 ScAAV9-hIGF1對(duì)ALS小鼠模型保護(hù)機(jī)制研究
目的:IGF1作為神經(jīng)生長(zhǎng)因子中的一員,對(duì)中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)都具有保護(hù)作用,大量實(shí)驗(yàn)表明 IGF1能夠促進(jìn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活,并證實(shí)在臨床實(shí)驗(yàn)中有很高的安全性。很多實(shí)驗(yàn),包括我們前部分的實(shí)驗(yàn),都證實(shí)了IGF1能夠延緩SOD1G93A ALS小鼠模型疾病的進(jìn)展,改善運(yùn)動(dòng)功能和延遲肌肉萎縮,減輕膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng),保護(hù)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)
14、元,延長(zhǎng)生存期。那么IGF1是通過(guò)什么機(jī)制對(duì)SOD1G93AALS小鼠模型起作用的呢?目前尚沒有一致的答案。據(jù)報(bào)道,IGF1能夠通過(guò)抑制凋亡保護(hù)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和減少神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞釋放腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和一氧化氮(NO)。另有實(shí)驗(yàn)表明鞘內(nèi)注射 IGF1能激活 PI3K/Akt和 ERK信號(hào)通路,促進(jìn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活,我們本部分實(shí)驗(yàn)的目的是進(jìn)一步研究IGF1對(duì)SOD1G93AALS小鼠模型的保護(hù)機(jī)制,為IGF1能夠真正用于患者提供可靠
15、實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
方法:
1同窩拷貝數(shù)相同的80天 SOD1G93A雄性小鼠隨機(jī)分為scAAV9-hIGF1干預(yù)組和AAV9-GFP對(duì)照組,肌肉注射部位包括;雙側(cè)咬肌、肱二頭肌、肱三頭肌、肋間肌、腹肌、股二頭肌、股四頭肌、腓腸??;10ul/肌,干預(yù)14d后麻醉,新鮮取材,迅速提取腰髓RNA,利用基因芯片篩選有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的基因。
290天和60天齡同窩拷貝數(shù)相同的 SOD1G93A ALS小鼠隨機(jī)分為scAAV9-
16、hIGF1干預(yù)組和 AAV9-GFP對(duì)照組,肌肉注射雙側(cè)的咬肌、肱二頭肌、肱三頭肌、肋間肌、腹肌、股二頭肌、股四頭肌、腓腸肌,10ul/肌。干預(yù)后110天取材,利用實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證選出的基因,用蛋白印跡和免疫熒光定量和定位蛋白的表達(dá)。
3運(yùn)用免疫熒光及蛋白印跡方法證實(shí)IGF1的抗凋亡機(jī)制,凋亡指標(biāo)包括TUNEL,cleaved-caspase3和9,Bax及Bcl-2。
4利用CRISPR-Cas9技術(shù),30天齡鞘
17、內(nèi)注射干預(yù),靶向敲除中樞神經(jīng)系統(tǒng)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的IGF1基因,90天齡取材,利用實(shí)時(shí)定量PCR,蛋白印跡及免疫組化、免疫熒光等技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證選出的基因。
結(jié)果:1基因芯片篩選結(jié)果發(fā)現(xiàn)scAAV9-hIGF1干預(yù)小鼠腰髓的DAO基因水平明顯高于AAV9-GFP對(duì)照組(P<0.05);2實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證scAAV9-hIGF1干預(yù)小鼠腰髓的DAO基因水平明顯高于AAV9-GFP對(duì)照組(P<0.05)。免疫熒光和蛋白印跡檢查顯示DAO
18、主要定位于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元,scAAV9-hIGF1治療組小鼠腰髓的DAO蛋白水平明顯高于AAV9-GFP對(duì)照組( P<0.05);3 ScAAV9-hIGF1治療組小鼠腰髓 TUNEL, cleaved-caspase3和9, Bax等促凋亡指標(biāo)下調(diào),抗凋亡Bcl-2上調(diào);4利用CRISPR-Cas9系統(tǒng),靶向敲降中樞神經(jīng)系統(tǒng)的IGF1基因,小鼠的癥狀明顯加重,DAO蛋白水平出現(xiàn)明顯下調(diào),D-serine水平隨之上升,同時(shí)cleaved-c
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