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文檔簡介
1、第一部分:海藻糖對過表達ALS相關(guān)毒性蛋白質(zhì)NSC-34細胞的干預(yù)研究
目的:本研究中,我們采用過表達ALS疾病相關(guān)蛋白質(zhì)的細胞為模型觀察海藻糖對這些毒性蛋白質(zhì)的自噬性降解有無促進作用,并觀察其能否減輕這些蛋白質(zhì)對細胞帶來的毒性作用。為探索自噬調(diào)控對ALS病理的影響提供體外實驗依據(jù)。
方法:用瞬時轉(zhuǎn)染的方法在NSC-34細胞系中過表達WTTDP-43,與家族型ALS相關(guān)的Q331KTDP-43,M337VTD
2、P-43突變蛋白質(zhì),TDP-43的C末端片段TDP-25和TDP-35,以及人WTSOD1和人突變型SOD1-G93A蛋白質(zhì)。再給予用不同濃度的海藻糖(25mM、50mM和100mM)進行干預(yù)。用免疫印跡法檢測LC3-Ⅱ及P62這兩種自噬通路的標記分子以及各種疾病相關(guān)蛋白質(zhì)的表達。觀察海藻糖對各類細胞的過表達蛋白質(zhì)是否有促進清除的作用。并應(yīng)用自噬通路的特異性阻斷劑3-MA和wortmannin來進一步驗證海藻糖的促蛋白質(zhì)降解作用機制是否
3、在自噬通路上。應(yīng)用自噬通路中自噬體和溶酶體的融合的阻斷劑bafilomycinA1來明確海藻糖的對LC3-Ⅱ的上調(diào)作用機制。免疫印跡的方法和流式細胞檢測方法檢測凋亡相關(guān)蛋白質(zhì)caspase-3和胞漿CytC的蛋白表達水平及ROS的水平。
結(jié)果:海藻糖能上調(diào)NSC-34細胞自噬,使自噬標記分子LC3-Ⅱ的表達水平明顯上調(diào)(P<0.05),自噬流的標記分子P62的表達水平明顯下降(P<0.05),而且這一促進自噬的作用是呈劑量
4、依賴性的,25mM時就有輕微的促進自噬的作用,100mM的劑量下促進自噬的作用最強,能使LC3-Ⅱ的表達含量最高,與之相應(yīng)的,100mM海藻糖降解疾病相關(guān)毒性蛋白質(zhì)的效果也最好。海藻糖可以促進TDP-43蛋白質(zhì)兩種突變形式及兩種截短形式TDP-25和TDP-35的降解(P<0.05),對野生型TDP-43的降解無明顯作用(P>0.05)。海藻糖可以促進野生型及突變型SOD1蛋白質(zhì)的降解(P<0.05)。自噬阻斷劑3-MA和wortman
5、nin均可以阻斷海藻糖上調(diào)LC3-Ⅱ的作用(P<0.05),同時可以阻斷其降解TDP-25截短片段的作用(P<0.05)。在自噬阻斷劑bafilomycinA1的干預(yù)下,海藻糖可以進一步上調(diào)LC3-Ⅱ的表達(P<0.05)。海藻糖可以減少TDP-25毒性片段帶來的細胞凋亡相關(guān)蛋白質(zhì)activecaspase-3和胞漿CytC的表達(P<0.05)。海藻糖可以減輕TDP-25毒性片段所致的細胞ROS的產(chǎn)生(P<0.05)。
6、結(jié)論:1、海藻糖能誘導(dǎo)過表達人野生型TDP-43,Q331KTDP-43,M337VTDP-43突變型以及TDP-25,TDP-35兩種毒性截短片段的NSC-34細胞自噬。其作用有劑量依賴性,100mM用量促進自噬作用最強。
2、海藻糖上調(diào)LC3-Ⅱ的表達是因為其增加了自噬體生成而非阻斷了自噬體和溶酶體的融合。
3、海藻糖能夠促進Q331KTDP-43,M337VTDP-43兩種突變型以及兩種毒性截短片段TD
7、P-25,TDP-35的降解,對野生型TDP-43無明顯降解作用。
4、海藻糖能使減少TDP-25毒性片段所致的細胞凋亡損傷及線粒體損傷。
第二部分:海藻糖對ALS轉(zhuǎn)基因小鼠突變SOD1的自噬性降解及炎癥反應(yīng)的干預(yù)研究
目的:本實驗中,我們應(yīng)用肌萎縮側(cè)索硬化轉(zhuǎn)基因G93A-SOD1小鼠及其同窩非轉(zhuǎn)基因小鼠為動物模型,給予其2%海藻糖短期干預(yù)一個月,觀察海藻糖能否對小鼠的自噬相關(guān)生化指標產(chǎn)生影響。
8、為下一步長期用藥對生存期觀察實驗提供體內(nèi)實驗依據(jù)。
方法:本實驗以肌萎縮側(cè)索硬化轉(zhuǎn)基因G93A-SOD1小鼠為動物模型,應(yīng)用美國Jackson實驗室提供的引物序列和鑒定方法對轉(zhuǎn)基因G93A-SOD1小鼠進行PCR鑒定并觀察過表達人突變型轉(zhuǎn)基因G93A-SOD1小鼠的表型特征。免疫印跡法檢測自噬的標記分子LC3-Ⅱ及P62的表達以及小鼠腰髓人突變型SOD1蛋白質(zhì)的表達變化。免疫熒光染色及免疫印跡法檢測海藻糖對轉(zhuǎn)基因G93A-
9、SOD1小鼠脊髓前角小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞的激活有何影響。
結(jié)果:海藻糖干預(yù)組的轉(zhuǎn)基因G93A-SOD1小鼠腰髓LC3-Ⅱ表達含量明顯升高(P<0.05),自噬流的標記分子P62表達明顯下降(P<0.05)。給予海藻糖的轉(zhuǎn)基因G93A-SOD1小鼠腰髓中突變SOD1蛋白的表達明顯下降(P<0.05)。給予海藻糖后小膠質(zhì)細胞的標記物CD11B和星形膠質(zhì)細胞膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprot
10、ein,GFAP)表達含量明顯降低(P<0.05)。免疫熒光染色顯示對照組轉(zhuǎn)基因G93A-SOD1小鼠腰髓小膠質(zhì)細胞Iba1和星形膠質(zhì)細胞GFAP免疫陽性較非轉(zhuǎn)基因小鼠明顯增強,膠質(zhì)細胞數(shù)量增多,細胞胞體增大,突起增粗增多。提示膠質(zhì)細胞處于激活增生狀態(tài)。而給予海藻糖干預(yù)的轉(zhuǎn)基因G93A-SOD1小鼠小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞增生的狀態(tài)被明顯抑制。
結(jié)論:1、海藻糖能上調(diào)轉(zhuǎn)基因G93A-SOD1小鼠脊髓組織中的自噬通路。
11、> 2、海藻糖能夠促進轉(zhuǎn)基因G93A-SOD1小鼠腰髓中突變SOD1蛋白質(zhì)的清除。
3、海藻糖能夠減輕轉(zhuǎn)基因G93A-SOD1小鼠腰髓中的小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞增生活化。
第三部分:海藻糖對ALS轉(zhuǎn)基因小鼠病程進展及行為學的干預(yù)研究
目的:本研究中,應(yīng)用肌萎縮側(cè)索硬化轉(zhuǎn)基因G93A-SOD1小鼠及其同窩非轉(zhuǎn)基因小鼠為動物模型,觀察海藻糖對小鼠ALS疾病進程和運動功能的改善作用,并對其作用
12、機制進行初步探討。
方法:本實驗應(yīng)用肌萎縮側(cè)索硬化轉(zhuǎn)基因G93A-SOD1雌鼠及其同窩非轉(zhuǎn)基因小鼠為動物模型,長期應(yīng)用2%海藻糖至小鼠疾病終末期。觀察長期應(yīng)用海藻糖對小鼠體重,神經(jīng)功能評分有無影響。并聯(lián)合轉(zhuǎn)棒實驗及吊籠實驗評價長期應(yīng)用海藻糖對小鼠運動功能的影響。用免疫印跡法檢測終末期小鼠腰髓自噬相關(guān)標記分子LC3-Ⅱ、P62以及人突變型SOD1的表達變化。用免疫熒光染色和免疫印跡法檢測海藻糖對終末期小鼠腰髓中小膠質(zhì)細胞和星
13、形膠質(zhì)細胞增生情況的影響。用免疫組織化學法NeuN標記神經(jīng)元,計數(shù)終末期轉(zhuǎn)基因G93A-SOD1小鼠腰髓前角運動神經(jīng)元的數(shù)量。
結(jié)果:海藻糖應(yīng)用2個月余對轉(zhuǎn)基因G93A-SOD1小鼠及其同窩非轉(zhuǎn)基因小鼠的體重有較輕微的減輕作用,這種減輕作用在絕大多數(shù)時間點無統(tǒng)計學意義。應(yīng)用海藻糖后,小鼠發(fā)?。瓷窠?jīng)功能評分1)的時間推遲了4天(對照組94.43±1.53天;海藻糖干預(yù)組98.71±1.46天;P<0.05),達到評分2的時
14、間推遲了6天(對照組111.57±2.22天;海藻糖干預(yù)組,117.93±2.43天;P<0.05),兩組比較有統(tǒng)計學差異。小鼠達到評分3及疾病終末期的時間(即達到神經(jīng)功能評分4)也分別的推遲了5天和3天(達到神經(jīng)評分3:對照組,126.0±2.84天;海藻糖干預(yù)組,131.5±2.6天;P>0.05,達到疾病終末:對照組,130.93±2.81天;海藻糖干預(yù)組,138.21±3.32天;P>0.05),但差異尚未達到統(tǒng)計學意義。小鼠轉(zhuǎn)
15、棒實驗在即第12周至15周(相當于神經(jīng)評分1分至2分期間),尤其是在第98天給藥組小鼠能力明顯好于對照組(P<0.05)。轉(zhuǎn)基因G93A-SOD1小鼠在第14周至16周(相當于神經(jīng)功能評分4分至2分期間)的吊籠運動功能,尤其是98天、102天、112天給藥組小鼠轉(zhuǎn)棒運動能力明顯好于對照組(P<0.05)。海藻糖可以顯著提高終末期轉(zhuǎn)基因G93A-SOD1小鼠脊髓LC3-Ⅱ的表達水平(<0.05),但不能降低P62及人突變型SOD1的表達水
16、平(P>0.05)。免疫組織化學NeuN染色顯示海藻糖干預(yù)組和對照組。轉(zhuǎn)基因G93A-SOD1小鼠腰髓前腳運動神經(jīng)元數(shù)量無明顯差異(P>0.05)。小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞的免疫熒光染色及免疫印跡法結(jié)果顯示海藻糖能明顯減輕終末期轉(zhuǎn)基因G93A-SOD1小鼠腰髓膠質(zhì)細胞增生活化的程度。
結(jié)論:1、海藻糖可以延遲轉(zhuǎn)基因G93A-SOD1小鼠的發(fā)病,推遲其病情進展到神經(jīng)功能評分2階段。但不能延遲轉(zhuǎn)基因G93A-SOD1小鼠病情進
17、展到神經(jīng)功能評分3階段,不能延長小鼠的生存期。
2、海藻糖可以在轉(zhuǎn)基因G93A-SOD1小鼠病程早期改善小鼠的運動功能,但這種改善作用隨著病程的進展逐漸減弱。
3、海藻糖可以促進終末期轉(zhuǎn)基因G93A-SOD1小鼠腰髓中自噬體的生產(chǎn),但不能有效降解突變的SOD1蛋白質(zhì)。
4、海藻糖能減輕終末期轉(zhuǎn)基因G93A-SOD1小鼠腰髓中的膠質(zhì)細胞增生。
5、海藻糖不能減輕終末期轉(zhuǎn)基因G93A-
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