鞘內(nèi)注射scAAV9-hIGF1對ALS小鼠模型運動神經(jīng)元保護作用及機制研究.pdf

1、肌萎縮側(cè)索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis，ALS)是一種慢性、進行性、致死性神經(jīng)變性疾病，發(fā)病率約為5／10萬至7／10萬，臨床患者約90％為散發(fā)性肌萎縮側(cè)索硬化(SALS)，余為家族性肌萎縮側(cè)索硬化(FALS)，二者的臨床表現(xiàn)及病理特點相似，患者一般在出現(xiàn)癥狀后的3～5年內(nèi)病情進行性加重，最終因肌肉萎縮無力、呼吸衰竭而死亡。目前尚無有效的治療方法。
　　SALS的病因還不明確。經(jīng)大量的FALS患

2、者研究證實，20%的病例由銅/鋅超氧化物歧化酶1基因(SOD1)突變引起。G93A-SOD1轉(zhuǎn)基因小鼠(ALS小鼠)模擬人類ALS疾病的臨床特點，被用作研究ALS病理機制的工具鼠。高拷貝數(shù)轉(zhuǎn)基因G93A-SOD1小鼠約在12周齡時后肢開始出現(xiàn)運動功能障礙癥狀，并逐漸進展，約17-20周齡發(fā)展到終末，病理表現(xiàn)與人ALS相似的致命的運動神經(jīng)元的變性。研究認為突變的SOD1蛋白錯誤折疊，易形成聚集體，對降解短壽命蛋白質(zhì)的泛素蛋白酶體系統(tǒng)抵抗，

3、具有細胞毒性，是導致家族性 ALS疾病的機制之一。自噬(autophagy)可以清除長壽命蛋白質(zhì)、錯誤折疊蛋白質(zhì)及衰老損傷細胞器，是高度保守的細胞生物學行為。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，自噬是清除錯誤折疊蛋白的重要途徑，以維持神經(jīng)元的正常生理功能。因此研究有效降解突變SOD1蛋白對ALS疾病治療具有重要意義。
　　胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor1,IGF1)含有70個氨基酸，是一種在分子結(jié)構上與胰島

4、素類似，相對分子質(zhì)量為7649，通過內(nèi)分泌、自分泌和旁分泌的三種途徑產(chǎn)生的低分子多肽。IGF-1參與生物體內(nèi)多種重要生理功能，其重要作用之一是有助于修復神經(jīng)的損害。應用腺相關病毒血清2型(adeno-associated virus2, AAV2)攜帶人單鏈IGF1基因(AAV2-hIGF1)肌肉注射經(jīng)神經(jīng)逆軸漿運輸干預 G93A-SOD1轉(zhuǎn)基因小鼠，其發(fā)病明顯推遲、生存期延長，研究發(fā)現(xiàn)IGF1激活ALS小鼠的脊髓運動神經(jīng)元自噬通路，抑

5、制運動神經(jīng)元凋亡，從而保護了運動神經(jīng)元，該實驗沒有報道突變的SOD1蛋白水平變化，我們推測可能是在自噬激活參與下使致病的SOD1蛋白水平下調(diào)減輕了對運動神經(jīng)元的毒性。
　　本研究我們應用親神經(jīng)的腺相關病毒血清9型(AAV9)攜帶編碼雙鏈的hIGF1基因(scAAV9-hIGF1)經(jīng)鞘內(nèi)注射的途徑干預G93A-SOD1轉(zhuǎn)基因小鼠，觀察其行為學變化，探索表達hIGF1對ALS小鼠突變SOD1蛋白表達及病理的影響，并進一步采用 CRIS

6、PR-Cas9系統(tǒng)，通過給G93A-SOD1轉(zhuǎn)基因雌性小鼠鞘內(nèi)注射 scAAV9-sgRNA-IGF1-Cas9以敲降小鼠自身IGF1，探索對ALS小鼠突變SOD1蛋白表達及病理是否呈反方向影響。我們查閱國內(nèi)外文獻類似報道極少。
　　第一部分鞘內(nèi)注射scAAV9-hIGF1對ALS小鼠模型行為學及突變SOD1蛋白的影響
　　目的：我們應用親神經(jīng)性的腺相關病毒血清型9(AAV9)攜帶編碼雙鏈的人IGF1基因(scAAV9-hI

7、GF1)經(jīng)鞘內(nèi)注射途徑干預60天齡、90天齡G93A-SOD1轉(zhuǎn)基因雌性小鼠，觀察干預后其行為學變化，研究表達hIGF1對ALS小鼠突變SOD1蛋白表達及病理的影響。
　　方法：我們選取美國 Jackson實驗室提供的肌萎縮側(cè)索硬化轉(zhuǎn)基因G93A-SOD1小鼠為動物模型，應用其提供的引物序列和鑒定方法對轉(zhuǎn)基因G93A-SOD1仔鼠進行DNA鑒定，陽性的G93A-SODl轉(zhuǎn)基因雌性小鼠經(jīng)同窩配對作為受試對象。60天齡時、90天齡時的

8、G93A-SOD1轉(zhuǎn)基因陽性同窩雌性小鼠隨機分配到藥物治療組鞘內(nèi)注射scAAV9-hIGF1，對照組鞘內(nèi)注射AAV9-GFP，各15對。另外選取60天齡時G93A-SOD1轉(zhuǎn)基因陽性同窩雌性小鼠10對，隨機分別給予鞘內(nèi)注射 scAAV9-hIGF1/AAV9-GFP，其中3對鞘內(nèi)注射3周時新鮮取材提取蛋白，采用酶聯(lián)免疫吸附實驗觀測轉(zhuǎn)染后hIGF1表達、分布特點，1對用4%的多聚甲醛液灌注固定，通過免疫熒光雙染觀測腰髓組織振蕩切片 hIG

9、F1表達特點；其中3對110天齡時用4%的多聚甲醛液灌注固定，通過免疫組織化學法、免疫熒光法觀測腰髓組織振蕩切片病理變化特征；余3對110天齡時新鮮取材，通過蛋白印跡分析研究GFAP、CD11b、SOD1、LC3、P62表達特點，通過RT-PCR研究SOD1的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。
　　結(jié)果：1所有納入實驗的小鼠經(jīng)DNA鑒定，核實為G93A-SOD1轉(zhuǎn)基因陽性的雌鼠。2給予 G93A-SOD1轉(zhuǎn)基因小鼠鞘內(nèi)注射scAAV9-hIGF1

10、/AAV9-GFP，3周時新鮮取材提取蛋白，酶聯(lián)免疫吸附實驗結(jié)果顯示 hIGF1在神經(jīng)組織中都有表達，腰段脊髓、胸段脊髓、頸段脊髓、腦干組織中 hIGF1濃度呈遞減趨勢，腰段脊髓hIGF1濃度最高，腦干組織中hIGF1最低；經(jīng)4%的多聚甲醛液灌注固定的腰髓組織振蕩切片免疫熒光雙染小顯示 hIGF1主要表達在運動神經(jīng)元。3給予G93A-SOD1轉(zhuǎn)基因小鼠鞘內(nèi)注射 scAAV9-hIGF1，改善了小鼠的運動功能，60天齡治療與對照組中位數(shù)相

11、比延遲發(fā)病20天、延長生存期44天，90天齡治療延長生存期38天(P﹤0.01)，認為治療組與對照組相比發(fā)病顯著推遲、生存期顯著延長。4 G93A-SOD1轉(zhuǎn)基因小鼠表達hIGF1，110天齡時灌注取材腰髓切片經(jīng)免疫熒光雙染色顯示結(jié)果顯示治療組的運動神經(jīng)元丟失較對照組明顯少；治療組星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞增生較對照組明顯少。同期取材的蛋白印跡結(jié)果顯示治療組GFAP、CD11b蛋白表達水平低于對照組(P﹤0.05)。5 G93A-SOD1

12、轉(zhuǎn)基因小鼠表達hIGF1，110天齡時新鮮腰髓取材的蛋白印跡顯示治療組的突變 SOD1蛋白表達水平低于對照組，治療組的LC3蛋白表達水平高于對照組，治療組的P62蛋白表達水平低于對照組，(P值均小于0.05)，差異有統(tǒng)計學意義；其脊髓腰彭大部分經(jīng)超聲勻漿用RNA試劑盒提取總RNA，經(jīng)RT-PCR反轉(zhuǎn)錄，治療組與對照組的ΔCT值經(jīng)統(tǒng)計分析，P﹥0.05，認為組間的SOD1的mRNA轉(zhuǎn)錄水平無差異。
　　第二部分表達hIGF1對ALS

13、小鼠模型運動神經(jīng)元保護作用研究
　　目的：我們給60天齡轉(zhuǎn)基因雌性小鼠鞘內(nèi)注射scAAV9-hIGF1，研究表達hIHG1如何抑制小膠質(zhì)細胞增生發(fā)揮對運動神經(jīng)元的保護。
　　方法：我們選取美國 Jackson實驗室提供的肌萎縮側(cè)索硬化轉(zhuǎn)基因G93A-SOD1小鼠為動物模型，應用其提供的引物序列和鑒定方法對轉(zhuǎn)基因G93A-SOD1小鼠進行PCR鑒定， DNA鑒定為SOD1陽性的轉(zhuǎn)基因G93A-SODl雌性小鼠經(jīng)同窩配對作為受試

14、對象。60天齡時的G93A-SOD1轉(zhuǎn)基因陽性同窩雌性小鼠6對隨機分配到藥物治療組鞘內(nèi)注射scAAV9-hIGF1，對照組鞘內(nèi)注射AAV9-GFP，其中3對110天齡時用4%的多聚甲醛液灌注固定，通過免疫熒光法染色觀測 TGF-β、Arginase、IKBα、IKKγ在腰髓神經(jīng)組織切片表達分布變化特征；余3對110天齡時新鮮取材，通過蛋白印跡分析研究iNOS、TNF-α、Arginase、TGF-β、CYLD、IKBα、IKKβ、IKK

15、γ、PP65表達特點。
　　結(jié)果：1 G93A-SOD1轉(zhuǎn)基因小鼠表達hIGF1，110天齡時組間的腰髓切片免疫熒光雙染色顯示治療組的Arginase、TGF-β主要表達在神經(jīng)元，其熒光強度水平高于對照組，Arginase、TGF-β的蛋白印跡灰度比對值經(jīng)統(tǒng)計學分析，認為治療組Arginase、TGF-β表達水平明顯高于對照組(P﹤0.05)。2 G93A-SOD1轉(zhuǎn)基因小鼠表達hIGF1，iNOS、TNF-α的蛋白印達水平明顯低

16、于對照組。3 G93A-SOD1轉(zhuǎn)基因小鼠表達hIGF1，110天齡時組間的腰髓切片免疫熒光雙染色顯示IKBα在神經(jīng)元、小膠質(zhì)細胞均有表達，治療組的熒光強度高于對照組；免疫熒光雙染色顯示IKBγ主要表達在小膠質(zhì)細胞，治療組的熒光強度低于對照組。蛋白印跡灰度比對結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計學分析顯示：治療組的 IKKβ、IKKγ、PP65表達水平明顯低于對照組(P﹤0.05)；治療組的CYLD、IKBα表達水平明顯高于對照組(P﹤0.05)。
　　第

17、三部分鞘內(nèi)注射scAAV9-sgRNA-IGF1-Cas9對ALS小鼠模型行為學影響及機制研究
　　目的：我們采用CRISPR-Cas9系統(tǒng)，通過給G93A-SOD1轉(zhuǎn)基因雌性小鼠鞘內(nèi)注射scAAV9-sgRNA-IGF1-Cas9，觀測敲降G93A-SOD1轉(zhuǎn)基因雌性小鼠IGF1的mRNA對其行為學的影響，進一步研究敲降IGF1對突變SOD1蛋白表達及NF-κB通路上信號分子的影響。
　　方法：我們選取美國 Jackson

18、實驗室提供的肌萎縮側(cè)索硬化轉(zhuǎn)基因G93A-SOD1小鼠為動物模型，應用其提供的引物序列和鑒定方法對轉(zhuǎn)基因 G93A-SOD1小鼠進行 PCR鑒定，DNA鑒定為 SOD1陽性的轉(zhuǎn)基因G93A-SODl雌性小鼠經(jīng)同窩配對作為受試對象。30天齡時的G93A-SOD1轉(zhuǎn)基因陽性同窩雌性小鼠7對隨機分配到藥物治療組鞘內(nèi)注射scAAV9-sgRNA-IGF1-Cas9，對照組鞘內(nèi)注射scAAV9-sgRNA-lacz-Cas9，觀察行為學變化、發(fā)病

19、及生存期。另外選取6對以同樣的干預方法進行機制研究，其中3對90天齡時用4%的多聚甲醛液灌注固定，通過免疫組織化學法、免疫熒光法觀測IKKβ、PP65在腰髓神經(jīng)組織切片表達分布變化特征；余3對90天齡時新鮮取材，通過蛋白印跡分析研究SOD1、LC3、P62、iNOS、TNF-α、Arginase、mIGF1、TGF-β、CYLD、IKBα、IKKβ、IKKγ、PP65表達特點。
　　結(jié)果：1敲降 G93A-SOD1轉(zhuǎn)基因小鼠 IG

20、F1，小鼠的體重、評分從70天齡時治療組較對照組低，同時轉(zhuǎn)輪在80天齡時治療組較對照組低，顯示運動功能損害治療組發(fā)生更早；發(fā)病、生存期中位數(shù)治療組與對照組相比：治療組提前10天發(fā)病，提前16天終末，數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計分析P﹤0.01，具有極顯著差異。2降G93A-SOD1轉(zhuǎn)基因小鼠IGF1，90天齡小鼠腰髓組織切片免疫組織化學方法染色SMI32、GFAP、Iba-1，結(jié)果顯示治療組的運動神經(jīng)元丟失較對照組明顯多，治療組星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞增

21、生較對照組明顯多。3敲降 G93A-SOD1轉(zhuǎn)基因小鼠 IGF1，蛋白印跡結(jié)果顯示：90天齡治療組突變 SOD1蛋白表達水平明顯高于對照組(P﹤0.05)。治療組的 LC3-BⅡ蛋白表達水平明顯低于對照組(P﹤0.05)。4敲降G93A-SOD1轉(zhuǎn)基因小鼠IGF1，90天齡時取其新鮮腰髓進行的蛋白印跡實驗結(jié)果顯示：治療組 Arginase、TGF-β、mIGF1的表達水平明顯低于對照組(P﹤0.05)。5敲降G93A-SOD1轉(zhuǎn)基因小鼠

22、IGF1，90天齡時取其新鮮腰髓進行蛋白印跡實驗，結(jié)果顯示治療組的iNOS、TNF-α蛋白表達水平明顯高于對照組(P﹤0.05)。6敲降G93A-SOD1轉(zhuǎn)基因小鼠IGF1，90天齡時灌注取材，腰髓膨大部分切片進行IKKβ、PP665免疫熒光雙染色，結(jié)果顯示PP65主要分布在小膠質(zhì)細胞，治療組小膠質(zhì)細胞數(shù)較對照組多，治療組的熒光強度強于對照組。IKKβ在小膠質(zhì)細胞和非小膠質(zhì)細胞均有表達；90天齡時取其新鮮腰髓進行蛋白印跡實驗結(jié)果顯示，治

23、療組的NF-κB信號通路正向調(diào)節(jié)因子IKKβ、IKKγ、PP65水平明顯高于對照組(P﹤0.05)，治療組的NF-κB信號通路負向調(diào)節(jié)因子CYLD、IKBα明顯低于對照組(P﹤0.05)。
　　結(jié)論：
　　1通過查閱文獻資料，綜合分析所取得的實驗結(jié)果，認為突變SOD1蛋白、炎性因子 iNOS、TNF-α、NF-κB通路、IGF1之間存在這樣的關聯(lián)，即在ALS小鼠表達hIGF1促進突變SOD1降解，減輕了運動神經(jīng)元的毒害作用，

24、iNOS、TNF-α呈現(xiàn)低表達，抑制小膠質(zhì)細胞增生，下調(diào)NF-κB通路信號因子表達，進一步減輕了對運動神經(jīng)元損傷性作用，臨床表現(xiàn)為ALS小鼠發(fā)病延遲、生存期延長。
　　2相反，在ALS小鼠脊髓敲降IGF1使突變SOD1降解受阻，其表達累積增加、毒性加劇，加重了對運動神經(jīng)元的毒害作用，iNOS、TNF-α呈現(xiàn)高表達，小膠質(zhì)細胞明顯增生，進而上調(diào)NF-κB通路信號因子表達，加重對運動神經(jīng)元產(chǎn)生了損害作用，因而臨床表現(xiàn)為提前發(fā)病、生存期

25、縮短。
　　3基于以上研究結(jié)果我們認為突變SOD1蛋白毒性致使運動神經(jīng)元發(fā)生炎性反應，炎性因子表達上調(diào)，刺激小膠質(zhì)細胞增生活化，炎性級聯(lián)發(fā)生，共同參與了ALS疾病的發(fā)生，但其信號介導通路仍有待進一步研究。
　　4通過對ALS小鼠基因治療表達hIGF1促進了突變SOD1蛋白降解，抑制了以上病理進展從而發(fā)揮了治療效應，屬于對因治療，為臨床 ALS疾病的治療提供了實驗依據(jù)，本實驗同時提示抑制炎性反應過程的各個環(huán)節(jié)都是治療ALS疾病