T-LAK細(xì)胞來源的蛋白激酶(TOPK)在食管鱗癌增殖中的功能研究.pdf

1、食管癌是我國(guó)癌癥的第四大死因，其死亡率高，預(yù)后差。目前食管癌治療的基本方法是手術(shù)結(jié)合放化療，但治療效果仍然有限，食管癌患者的五年生存率僅為17％，低于我國(guó)腫瘤患者五年生存率的中位數(shù)。食管癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制尚不完全明確，因而必須深入了解食管癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制，才能制定有效的治療方案，進(jìn)而降低食管癌的死亡率和發(fā)生率。食管鱗狀細(xì)胞癌（Esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）是我國(guó)食管癌的主要類型，其發(fā)生發(fā)展過

2、程與多個(gè)信號(hào)通路的異常激活有關(guān)。因此，篩選新的治療靶點(diǎn)并制定有效的治療方案是食管鱗癌臨床亟待解決的問題之一。
　　癌癥基因譜研究發(fā)現(xiàn)食管鱗癌中存在79個(gè)促進(jìn)ESCC發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵基因，這些基因涉及基因組穩(wěn)定、細(xì)胞存活和細(xì)胞生存的12個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，近期研究證實(shí)AKT、RAS等多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常是促進(jìn)食管鱗癌發(fā)生發(fā)展的因素之一，并參與ESCC的增殖、轉(zhuǎn)移、分化等多個(gè)過程。因此，闡明食管鱗癌中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作用機(jī)制，篩選信號(hào)通路的關(guān)

3、鍵靶點(diǎn)及其抑制劑，可以為阻斷食管鱗癌發(fā)生發(fā)展制定有效的治療方案，為提高ESCC患者生存率提供理論支持。
　　T-LAK細(xì)胞來源的蛋白激酶(T-LAK cell-originated Protein kinase，TOPK)，是一種新發(fā)現(xiàn)的絲-蘇氨酸激酶，屬于MAPKK分子家族，系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示它是MEK1/2和MKK7之間的分支，其參與多種生物學(xué)過程，如腫瘤的發(fā)生發(fā)展、細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡以及炎癥等過程。TOPK的活化是有絲

4、分裂早期的重要步驟，TOPK和cdk1/cyclin B1復(fù)合體結(jié)合，使胞質(zhì)分裂蛋白1磷酸化，從而促使細(xì)胞分裂，從而加速細(xì)胞G2/M期進(jìn)程促進(jìn)細(xì)胞的增殖。TOPK激酶甚至可以和腫瘤抑制基因p53的DCD結(jié)構(gòu)域相結(jié)合從而阻斷p53的作用，促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白如p21的表達(dá)。近來研究還發(fā)現(xiàn)Cdk1激活調(diào)控的TOPK激酶活化后，可以瞬時(shí)調(diào)節(jié)在細(xì)胞分裂中的多種DNA連接蛋白，并且可以在幾分鐘內(nèi)調(diào)控這些蛋白的前體。C2H2鋅指蛋白就是這一大類保守蛋白

5、，其包含有多個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域的保守區(qū)域，TOPK激酶是首個(gè)證實(shí)在有絲分裂中可以和這些保守區(qū)域結(jié)合進(jìn)而調(diào)控整個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的蛋白激酶。TOPK在白血病、淋巴瘤、乳腺癌、皮膚癌、宮頸癌、肺癌和結(jié)腸癌等多種惡性腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)，并且和腫瘤預(yù)后密切相關(guān)。TOPK在這些不同的腫瘤中通過激活不同的信號(hào)通路參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移，甚至還參與了腫瘤耐藥的形成，降低了腫瘤治療的有效性。替普瑞酮和甲羥戊酸治療抵抗的乳腺癌患者中，Yes相關(guān)蛋白(Yes-assoc

6、iated protein,YAP)誘導(dǎo)的TOPK蛋白表達(dá)增加對(duì)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖起到了重要作用。此外，報(bào)道TOPK激酶通過直接磷酸化c-Jun S73和S63促進(jìn)肺癌細(xì)胞對(duì)EGFR抑制劑吉非替尼耐藥性的產(chǎn)生。這些研究表明TOPK有可能成為腫瘤治療的有效治療靶點(diǎn)。
　　然而，TOPK在食管鱗癌中的功能及其機(jī)制尚沒有文獻(xiàn)報(bào)道，因此，進(jìn)一步研究TOPK在食管鱗癌中的功能及其機(jī)制可以為TOPK成為食管鱗癌的治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。本課題通

7、過三個(gè)部分來研究TOPK在食管鱗癌中的功能及其機(jī)制，利用食管癌組織芯片檢測(cè)TOPK在食管鱗癌中的表達(dá)水平，評(píng)價(jià)TOPK與食管鱗癌病理特征及患者預(yù)后的相關(guān)性；采用慢病毒載體、轉(zhuǎn)染、篩選出TOPK低表達(dá)細(xì)胞系，和TOPK抑制劑HI-TOPK-032這2種方法評(píng)價(jià)TOPK下調(diào)對(duì)食管鱗癌細(xì)胞增殖的影響；進(jìn)而通過激酶芯片技術(shù)探討TOPK下調(diào)后引起的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路改變，將表面等離子共振技術(shù)(surface plasma resonance techn

8、ology，SPR)和質(zhì)譜(mass spectrometry，MS)聯(lián)用篩選出TOPK激酶磷酸化的作用靶點(diǎn)Y盒子結(jié)合蛋白1（Y box protein1,YB1），MS篩選發(fā)現(xiàn)TOPK磷酸化YB1的位點(diǎn)Thr89和Ser209;以siRNA下調(diào)YB1的表達(dá)觀察YB1在食管鱗癌細(xì)胞中的作用及其相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的改變；使用TOPK敲低穩(wěn)定表達(dá)的食管鱗癌細(xì)胞系裸鼠移植瘤模型和構(gòu)建的食管鱗癌患者來源的移植瘤（patient-derived x

9、enograft，PDX）模型評(píng)價(jià)以TOPK為靶點(diǎn)在體內(nèi)抑制食管鱗癌移植瘤生長(zhǎng)的效果，為TOPK作為食管鱗癌患者靶向治療的新靶標(biāo)提供理論依據(jù)。
　　第一部分 TOPK在人食管鱗癌中的表達(dá)及其臨床相關(guān)性評(píng)價(jià)方法：
　　1、以癌旁組織為對(duì)照，免疫組化方法檢測(cè)組織芯片中100例食管鱗癌TOPK的表達(dá)。
　　2、統(tǒng)計(jì)分析TOPK與食管鱗癌患者臨床病理特征（性別、年齡、分化和腫瘤浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移）的相關(guān)性，評(píng)價(jià)TOPK的表達(dá)與食

10、管鱗癌患者預(yù)后的關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　1、與食管鱗癌癌旁組織相比，TOPK在食管鱗癌中高表達(dá)
　　TOPK陽(yáng)性表達(dá)主要于細(xì)胞漿和/或細(xì)胞核，呈不同強(qiáng)度棕黃色染色。根據(jù)score值不同分為低表達(dá)組(Score≤3)和高表達(dá)組(Score>3)，100例病人中TOPK高表達(dá)66例，低表達(dá)34例,而癌旁正常組織中為陰性表達(dá)。
　　2、TOPK的表達(dá)與食管鱗癌患者病理特征的相關(guān)性
　　將TOPK的表達(dá)按照食管鱗癌

11、臨床資料(年齡，性別，分化，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤浸潤(rùn))進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示，在無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移食管鱗癌病人中TOPK低表達(dá)為21例，占43.48%，高表達(dá)為25例，占56.52%，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移食管鱗癌病人中TOPK低表達(dá)13例，占25.93%，高表達(dá)41例，占74.07%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，X2=5.154，P=0.023。而TOPK的表達(dá)和食管鱗癌患者的年齡、性別、腫瘤的分化、腫瘤浸潤(rùn)程度沒有相關(guān)性(P>0.05)。
　　3、TO

12、PK高表達(dá)預(yù)示食管鱗癌患者生存期短，預(yù)后差
　　100例食管鱗癌患者中，TOPK高表達(dá)組患者為66例，存活期為19.82±2.03月；TOPK低表達(dá)組食管鱗癌患者為34例，生存期為49.75±5.89月，P<0.001。將食管鱗癌患者的生存期和TOPK的表達(dá)采用Kaplan-meier法進(jìn)行存活相關(guān)性分析，經(jīng)Log Rank統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，Cox多因素回歸分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TOPK的高表達(dá)與食管鱗癌患者生存期具有相關(guān)性（P<0.001）。<

13、br>　　第二部分下調(diào)TOPK抑制食管鱗癌細(xì)胞的增殖及其分子機(jī)制研究
　　第一章下調(diào)TOPK對(duì)食管鱗癌細(xì)胞EC9706和TE13增殖的抑制作用
　　方法：
　　1、Western Blotting篩選食管鱗癌細(xì)胞系中TOPK表達(dá)情況。
　　2、慢病毒轉(zhuǎn)染建立食管鱗癌細(xì)胞EC9706和TE13TOPK敲低穩(wěn)定細(xì)胞系，Western Blotting評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染效率。
　　3、CCK8實(shí)驗(yàn)和軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)T

14、OPK敲低后對(duì)食管鱗癌細(xì)胞系EC9706和TE13的增殖和克隆形成的抑制作用。
　　4、CCK8實(shí)驗(yàn)和軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)TOPK抑制劑HI-TOPK-032對(duì)食管鱗癌細(xì)胞系EC9706和TE13的增殖和克隆形成的抑制作用。
　　結(jié)果：
　　1、TOPK在食管鱗癌細(xì)胞系中的表達(dá)和TOPK敲低穩(wěn)定細(xì)胞系的建立
　　TOPK在TE1、TE13、EC9706和EC1細(xì)胞系中呈高表達(dá)。通過慢病毒轉(zhuǎn)染、篩選建立TOPK敲

15、低穩(wěn)定細(xì)胞系EC9706 shTOPK#1和EC9706 shTOPK#2，TE13 shTOPK#1和TE13 shTOPK#2細(xì)胞系，其TOPK的表達(dá)相比對(duì)照組shMock明顯下調(diào)。
　　2、敲低TOPK后抑制食管鱗癌細(xì)胞系EC9706和TE13的增殖和克隆形成
　　CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，在EC9706和TE13細(xì)胞中敲低TOPK明顯抑制細(xì)胞增殖；軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，在EC9706和TE1

16、3細(xì)胞中敲低TOPK明顯抑制克隆形成。
　　3、TOPK抑制劑HI-TOPK-032抑制食管鱗癌細(xì)胞系EC9706和TE13的增殖和克隆形成
　　CCK8實(shí)驗(yàn)和軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，HI-TOPK-032明顯抑制EC9706和TE13細(xì)胞的增殖和克隆形成。
　　第二章下調(diào)TOPK抑制食管鱗癌細(xì)胞系中信號(hào)通路的激活
　　方法：
　　1、利用蛋白激酶芯片檢測(cè)TOPK敲低對(duì)EC9706細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

17、通路的影響
　　2、Western blotting方法驗(yàn)證TOPK敲低后EC9706和TE13的信號(hào)通路的改變
　　3、Western blotting方法檢測(cè)HI-TOPK-032作用24h后對(duì)EC9706和TE13的信號(hào)通路的改變
　　結(jié)果:
　　1、蛋白激酶芯片檢測(cè)TOPK敲低對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響
　　芯片結(jié)果顯示:和對(duì)照shMock組相比，Akt1/2/3 S473在EC9706shTOPK#1和

18、EC9706shTOPK#2分別下降至0.33和0.49倍；Akt1/2/3 T308分別下降至0.85和0.51倍；p70S6kinase T421/S424分別下降至0.57和0.23倍；ERK1/2 T202/Y204分別下降至0.81和0.79倍。
　　2、Western blotting法驗(yàn)證蛋白激酶芯片結(jié)果
　　EC9706和TE13中敲低TOPK或HI-TOPK-032作用均可抑制AKT/mTOR/p70S6K

19、和ERK信號(hào)通路的激活，該結(jié)果和蛋白激酶芯片結(jié)果一致。
　　第三章 TOPK下游分子靶點(diǎn)的研究
　　方法:
　　1、通過表面等離子共振技術(shù)篩選TOPK激酶在EC9706細(xì)胞中的作用靶點(diǎn)，結(jié)合質(zhì)譜分析結(jié)果和驗(yàn)證，推測(cè)出Y盒子結(jié)合蛋白1（Y-box binding protein1，YB1）是TOPK下游靶點(diǎn)之一。
　　2免疫組化觀察TOPK和YB1在食管鱗癌組織中的共定位，細(xì)胞免疫熒光方法觀察TOPK和YB1在食管

20、鱗癌細(xì)胞EC9706和TE13中的共定位。
　　3、免疫沉淀方法檢測(cè)外源性和內(nèi)源性TOPK和YB1的結(jié)合情況。
　　4、體外激酶檢測(cè)TOPK激酶能否磷酸化YB1，質(zhì)譜分析TOPK激酶磷酸化YB1的具體位點(diǎn)。
　　結(jié)果:
　　1、SPR和MS技術(shù)聯(lián)用篩選在EC9706中與TOPK激酶結(jié)合的蛋白
　　SPR獲得的EC9706蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析，將GST-TOPK蛋白、TOPK激酶組和對(duì)照組進(jìn)行比較，選取Score

21、值大于25的蛋白。我們重點(diǎn)分析與TOPK激酶結(jié)合的32個(gè)蛋白，經(jīng)過二級(jí)質(zhì)譜確定，我們選定YB1作為下一步研究的對(duì)象,推測(cè)TOPK激酶激活YB1進(jìn)而參與TOPK激酶下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活。
　　2、TOPK與YB1在食管鱗癌組織和食管鱗癌細(xì)胞中共定位
　　免疫組化結(jié)果顯示YB1和TOPK在食管鱗癌組織中能夠同時(shí)出現(xiàn)在細(xì)胞漿內(nèi)，免疫熒光結(jié)果顯示，食管鱗癌細(xì)胞系EC9706和TE13里，TOPK與YB1能夠同時(shí)出現(xiàn)于細(xì)胞質(zhì)中。說明

22、TOPK與YB1在食管鱗癌細(xì)胞中能夠共定位。3內(nèi)外源性TOPK與YB1可以相互結(jié)合
　　通過免疫共沉淀證實(shí)HEK293細(xì)胞里過表達(dá)的TOPK和過表達(dá)的YB1相互結(jié)合,證實(shí)HEK293細(xì)胞中外源性TOPK能與YB1結(jié)合;EC9706細(xì)胞中YB1能夠被TOPK抗體特異性地下拉，證實(shí)EC9706細(xì)胞中內(nèi)源性TOPK能與YB1結(jié)合。
　　4、TOPK在體外磷酸化YB1蛋白的Thr89和Ser209
　　體外激酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)TOPK

23、激酶能夠在體外磷酸化YB1；擴(kuò)大體外激酶樣本量，通過質(zhì)譜篩選到證實(shí)體外TOPK磷酸化YB1的兩個(gè)磷酸化位點(diǎn)是Thr89和Ser209。
　　第四章 YB1在食管鱗癌細(xì)胞系EC9706和TE13細(xì)胞增殖中的作用
　　方法:
　　1、采用Western Blotting方法檢測(cè)多個(gè)食管鱗癌細(xì)胞系中YB1的表達(dá)。
　　2、通過siRNA干擾食管鱗癌細(xì)胞系EC9706和TE13細(xì)胞中YB1的表達(dá)，進(jìn)一步以CCK8和軟瓊脂

24、集落形成實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)YB1下調(diào)對(duì)EC9706和TE13細(xì)胞增殖和克隆形成的影響。
　　3、Western Blotting法檢測(cè)通過siRNA干擾YB1下調(diào)后對(duì)TOPK，p-TOPK及AKT/mTOR/p70S6K和ERK信號(hào)通路的影響。
　　結(jié)果:
　　1、YB1在食管鱗癌細(xì)胞系中的表達(dá)
　　為了評(píng)價(jià)YB1在食管鱗癌中的表達(dá)，我們檢測(cè)了多個(gè)食管鱗癌細(xì)胞系中YB1的表達(dá)，結(jié)果顯示YB1在多個(gè)食管鱗癌細(xì)胞系中均呈現(xiàn)不同

25、程度表達(dá)，提示YB1的高表達(dá)和食管鱗癌細(xì)胞的生物學(xué)特性相關(guān)。
　　2、下調(diào)YB1抑制食管鱗癌細(xì)胞系EC9706和TE13的生長(zhǎng)和克隆形成
　　siRNA結(jié)果顯示YB1在食管鱗癌細(xì)胞系EC9706和TE13中的表達(dá)明顯降低，CCK8實(shí)驗(yàn)和軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示下調(diào)YB1的表達(dá)可以抑制EC9706和TE13細(xì)胞的增殖和克隆形成。
　　3、下調(diào)YB1對(duì)食管鱗癌細(xì)胞系EC9706和TE13中p-TOPK和TOPK的表達(dá)無(wú)影

26、響，而抑制AKT/mTOR/p70S6K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活
　　Western blotting結(jié)果證實(shí)，在EC9706和TE13細(xì)胞中，下調(diào)YB1對(duì)p-TOPK和TOPK的表達(dá)并無(wú)影響，卻明顯抑制AKT/mTOR/p70S6K信號(hào)通路的活化，對(duì)ERK通路影響較小。
　　第三部分下調(diào)TOPK對(duì)EC9706細(xì)胞移植瘤和人食管鱗癌組織來源的移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用
　　第一章 TOPK下調(diào)抑制食管鱗癌細(xì)胞生長(zhǎng)
　　方法:

27、
　　1、構(gòu)建EC9706shMock、EC9706 shTOPK#1和EC9706shTOPK#2細(xì)胞裸鼠移植瘤模型，通過測(cè)量腫瘤體積大小，小鼠體重、飲食飲水來評(píng)價(jià)TOPK敲低后在體內(nèi)對(duì)食管鱗癌細(xì)胞增殖的影響。
　　2、通過免疫組化評(píng)價(jià)裸鼠移植瘤模型中增殖相關(guān)蛋白Ki67、TOPK和p-TOPK及TOPK下游信號(hào)通路的變化。
　　結(jié)果:
　　1、裸鼠移植瘤生長(zhǎng)期間移植瘤體積、小鼠體重、飲食和飲水的改變情況

28、>　　皮下注射細(xì)胞后第7d開始測(cè)量腫瘤體積，第13d即可觀察到實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照明顯差異；生長(zhǎng)期間實(shí)驗(yàn)組小鼠體重、飲食和飲水和對(duì)照組無(wú)差異。
　　2、實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)各組移植瘤體積、質(zhì)量的情況
　　第21d處死小鼠，測(cè)量各組移植瘤體積，并稱量各組移植瘤質(zhì)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，EC9706shTOPK#1和EC9706shTOPK#2組瘤體積和質(zhì)量均減少（P<0.001）。
　　3、免疫組化檢測(cè)移植瘤中信號(hào)通路的激活情況

29、　　免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，移植瘤中EC9706shTOPK#1和shTOPK#2組中TOPK、p-TOPK、Ki67和AKT、mTOR和p70S6K磷酸化水平下降（P<0.05）。
　　第二章構(gòu)建人食管鱗癌組織來源的移植瘤模型
　　方法:
　　1、通過收集人食管鱗癌患者手術(shù)標(biāo)本26例，皮下移植入重度聯(lián)合免疫缺陷（severe combined immunodeficiency，SCID）小鼠，生長(zhǎng)，傳代。

30、>　　2、通過繪制移植瘤生長(zhǎng)曲線、HE染色和CK5/6、p40、p60的免疫組化評(píng)價(jià)評(píng)價(jià)構(gòu)建的PDX模型。
　　結(jié)果:
　　1、食管鱗癌病人臨床資料
　　2、6個(gè)病例中，14例病人成功建立PDX模型，成功率為53.8%。26個(gè)病人中17個(gè)男性，9個(gè)女性，年齡范圍為46-82歲，II期17人，III期3人，II-III期2人，I期3人，I-II期1人。
　　2、ESCC PDX移植瘤的生長(zhǎng)曲線、病理學(xué)評(píng)價(jià)及免疫組化

31、分析
　　從建立的14例ESCC PDX移植瘤模型中，選取EG2，EG3和EG5三例為代表，生長(zhǎng)曲線結(jié)果顯示第三代腫瘤生長(zhǎng)時(shí)間較前兩代縮短；HE病理和CK5/6、p40、p63免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)移植瘤組織病理類型和3個(gè)指標(biāo)陽(yáng)性表達(dá)與原代病人腫瘤組織一致。
　　第三章 HI-TOPK-032抑制人食管癌組織來源的移植瘤模型的生長(zhǎng)
　　方法:
　　1、用Western blotting方法從構(gòu)建成的ESCC PDX模型

32、中篩選出p-TOPK陽(yáng)性（EG5）和陰性（EG2）表達(dá)的移植瘤模型為對(duì)象，用TOPK抑制劑HI-TOPK-032分別對(duì)EG5和EG2兩例移植瘤進(jìn)行治療，通過測(cè)量?jī)衫浦擦鲶w積大小，小鼠體重、飲食飲水來評(píng)價(jià)TOPK抑制劑HI-TOPK-032對(duì)人食管鱗癌組織生長(zhǎng)的影響。
　　2、通過免疫組化評(píng)價(jià)HI-TOPK-032治療的兩組ESCC PDX模型移植瘤中p-TOPK、p-AKT473、p-mTOR，p-p70S6K等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白

33、及細(xì)胞增殖指標(biāo)Ki67的變化。
　　結(jié)果:
　　1、病人的臨床資料
　　p-TOPK陽(yáng)性病例EG5和p-TOPK陰性病例EG2均來自鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，食管鱗癌手術(shù)前均沒有進(jìn)行放化療。EG2和EG5的病人均為食管鱗癌，男性，年齡分別為64歲和61歲，分化類型分別為中高分化和中分化，二者分期均為IIa(T2N0M0)期，均無(wú)遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。
　　2、HI-TOPK-032治療期間的小鼠移植瘤的體積、體重、飲食和飲

34、水的改變情況
　　EG5移植瘤從給藥第12天起，給藥組比對(duì)照組移植瘤體積減少，P=0.002。而EG2移植瘤給藥過程中給藥組比對(duì)照組移植瘤體積未見到明顯差異。每周兩次稱量EG5和EG2組小鼠體重、飲食、飲水發(fā)現(xiàn)給藥組和溶劑對(duì)照組的沒有差異，P>0.05。
　　3、實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)各組小鼠移植瘤體積、質(zhì)量的情況
　　實(shí)驗(yàn)在第29天終止，EG5治療組瘤體積與對(duì)照組相比明顯減小(P=0.001)。而EG2移植瘤體積對(duì)照組和治療組差

35、異不明顯，P>0.05。EG5治療組瘤質(zhì)量與對(duì)照組明顯減少，P=0.004；而EG2移植瘤質(zhì)量治療組和對(duì)照組差異不明顯，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05。
　　4、免疫組化檢測(cè)PDX模型中信號(hào)通路蛋白磷酸化的改變情況
　　經(jīng)HI-TOPK-032治療的TOPK陽(yáng)性EG5組移植瘤組織EG5中p-TOPK、p-AKT473、p-mTOR，p-p70S6K等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白及細(xì)胞增殖指標(biāo)Ki67明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0

36、.05。而在TOPK陰性的EG2組人食管鱗癌移植瘤組織中各指標(biāo)改變不明顯，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05。
　　全文結(jié)論
　　1、TOPK在食管鱗癌中的表達(dá)比癌旁正常組織增高，和食管鱗癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，和食管鱗癌病人預(yù)后呈相關(guān)，而與食管鱗癌病人的其他臨床特征（性別、年齡、分化和腫瘤浸潤(rùn)）無(wú)關(guān)。
　　2、降低TOPK的表達(dá)可以抑制食管鱗癌細(xì)胞的增殖和食管鱗癌移植瘤的生長(zhǎng)，提示TOPK在食管鱗癌增殖中發(fā)揮重要作用

37、，TOPK有望成為食管鱗癌預(yù)防和治療的重要分子靶標(biāo)。
　　3、降低TOPK的表達(dá)可以抑制AKT/mTOR/p70S6K和ERK信號(hào)通路的激活，TOPK激酶在Thr89和Ser209位點(diǎn)磷酸化YB1，下調(diào)YB1可以抑制食管鱗癌細(xì)胞的增殖和AKT/mTOR/p70S6K信號(hào)通路的激活，提示TOPK磷酸化YB1進(jìn)而激活A(yù)KT/mTOR/p70S6K信號(hào)通路是TOPK促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞增殖的機(jī)制之一。
　　4、成功構(gòu)建人食管鱗癌組織來