P21激活的磷酸化蛋白激酶5在牙周病中的細(xì)胞功能探索.pdf

1、研究背景：細(xì)胞內(nèi)大部分重要的生命過(guò)程，如代謝、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、黏附、生長(zhǎng)、發(fā)育、調(diào)亡、肌肉收縮、免疫細(xì)胞激活、神經(jīng)活動(dòng)、應(yīng)激反應(yīng)以及腫瘤疾病的發(fā)生都涉及蛋白磷酸化，而且這種可逆性的蛋白磷酸化也是多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的重要環(huán)節(jié)。在可逆性的蛋白磷酸化過(guò)程中，涉及兩個(gè)相反的過(guò)程和兩種作用相反的物質(zhì)：蛋白激酶介導(dǎo)的磷酸化和磷酸酶介導(dǎo)的去磷酸化。蛋白激酶是一類磷酸轉(zhuǎn)移酶，其作用是將γ-ATP的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到底物特定的氨基酸殘基上，使蛋白質(zhì)磷酸化，發(fā)揮其生

2、理生化功能。蛋白激酶在口腔細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及牙周病中的功能在近十年內(nèi)才有了較多的認(rèn)識(shí)和研究。P21激活的磷酸化蛋白激酶(PAKs)是一組高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，作為Rho家族中小GTP酶，Rac和Cdc42下游的效應(yīng)因子以及MAPK信號(hào)通路上游的調(diào)控因子，包括2個(gè)亞家族(PAKI和PAKII)，6個(gè)家族成員(PAK1-6)。PAKs在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化、基因調(diào)節(jié)，細(xì)胞骨架重排以及細(xì)胞調(diào)亡等過(guò)程中起到重要作用。PAK5是一種最

3、近被證實(shí)而且很少被了解的p21激活的磷酸化蛋白激酶家族成員之一，在結(jié)構(gòu)上與PAK4類似，屬于PAKII亞家族。研究表明蛋白激酶在口腔細(xì)胞中參與重要的功能調(diào)節(jié)，如參與牙周膜細(xì)胞的成骨分化，牙槽骨代謝通路的調(diào)節(jié)以及在放線伴放線桿菌感染的牙周炎時(shí)參與口腔上皮細(xì)胞調(diào)亡的調(diào)控等。但是目前還沒(méi)有文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)PAKs家族在口腔細(xì)胞及牙周病中細(xì)胞生物學(xué)方面的研究，本實(shí)驗(yàn)試圖建立PAK5與口腔細(xì)胞尤其是牙周細(xì)胞生物學(xué)功能的聯(lián)系，為牙周病的發(fā)病機(jī)制的研究甚至

4、治療提供實(shí)驗(yàn)材料。 研究目的：通過(guò)基因重組技術(shù)，克隆PAK5氨基端基因，構(gòu)建pGEX-4T-1-PAK5氨基端表達(dá)載體，誘導(dǎo)其在E.coli中表達(dá)，純化蛋白表達(dá)產(chǎn)物并制備多克隆抗體，為進(jìn)一步研究PAK5在口腔細(xì)胞中相互作用蛋白及其在相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的作用提供重要的研究基礎(chǔ)。 研究方法：(1)PAK5氨基端基因片斷的擴(kuò)增與克隆。利用人類cDNA文庫(kù)中PAK5全基因序列，設(shè)計(jì)引物，RT-PCR擴(kuò)增氨基端基因，將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆

5、至pGEX-4T-1載體中，經(jīng)EcoRI/XhoⅠ雙酶切后進(jìn)行重組質(zhì)粒鑒定，DAN測(cè)序。(2)蛋白的表達(dá)、純化，多克隆抗體制備及鑒定。pGEX-4T-1-PAK5氨基端重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL21受體菌、氨芐青霉素平板篩選、挑選陽(yáng)性克隆、IPTG小量誘導(dǎo)后，挑選被誘導(dǎo)的菌株進(jìn)行大量誘導(dǎo)。蛋白產(chǎn)物由GST-融合蛋白純化系統(tǒng)純化。最后得到的純化蛋白粗略定量后送與抗體制備。Westernblotting對(duì)所得抗體進(jìn)行檢測(cè)。(3)PAK5在

6、口腔細(xì)胞中的表達(dá)。Westernblotting及細(xì)胞免疫熒光染色鑒定PAK5在牙胚細(xì)胞中的表達(dá)。Westernblotting鑒定部分牙周病患者齦溝液中PAK5的表達(dá)。 結(jié)果：(1)成功克隆了PAK5氨基端基因，構(gòu)建了pGEX-4T-1-PAK5氨基端重組質(zhì)粒，經(jīng)EcoRI/XhoI雙酶切后，瓊脂糖凝膠電泳及DNA測(cè)序證明克隆基因與目的基因相符。(2)pGEX-4T-1-PAK5氨基端重組質(zhì)粒在轉(zhuǎn)化E.coliBL21受體菌后

7、，在IPTG誘導(dǎo)下中成功表達(dá)了目的蛋白。利用GST-融合蛋白純化系統(tǒng)得到了純化的目的蛋白，通過(guò)免疫家兔制備了多克隆抗體，并經(jīng)親和層析柱純化了抗體。(3)。Westernblotting結(jié)果及細(xì)胞免疫熒光染色表明，PAK5在牙胚細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)。部分牙周病病人的齦溝液中也可以檢測(cè)到PAK5的表達(dá)。 結(jié)論：(1)利用基因重組技術(shù)，成功克隆了PAK5氨基端基因，表達(dá)并純化了的目的蛋白，制備了多克隆抗體，為進(jìn)一步研究PAK5在口腔細(xì)胞中的