農(nóng)桿菌介導(dǎo)的菜心遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)以廣東特產(chǎn)菜心品種“油青四九”為材料,研究菜心高頻再生體系的構(gòu)建,農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化過程中各種參數(shù)的確定,再生植株的檢測等問題。并以菜心帶柄子葉為外植體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法將(E)-β—farnesene(EβF)基因轉(zhuǎn)入菜心基因組中獲得轉(zhuǎn)基因再生植株,主要結(jié)果分析如下:
　　 高頻再生體系的建立是遺傳轉(zhuǎn)化成功的前提條件,而高頻再生體系的建立和外植體的種類、苗齡、激素濃度等試驗(yàn)條件有密切關(guān)系。本試驗(yàn)通過對(duì)“油青四九”菜心帶

2、柄子葉、下胚軸和子葉切塊等外植體的研究,發(fā)現(xiàn)帶柄子葉作為再生體系的外植體較為合適。同時(shí)對(duì)3～7d苗齡帶柄子葉、6-BA和NAA濃度組合,以及AgNO3對(duì)“油青四九”再生體系的影響研究,得到“油青四九”菜心帶柄子葉外植體最佳離體再生條件:1/2倍NH4+濃度的MS+3mg/L6-BA+1mg/L NAA+7mg/L AgNO3+2％蔗糖+0.8％瓊脂(pH=5.8)。
　　 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法研究深入,技術(shù)成熟,使用范圍廣,尤其適合雙子

3、葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化。本試驗(yàn)采用凍融法將含有目的基因的表達(dá)載體pBJ40轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404當(dāng)中,使用抗生素Str、Rif、Kan對(duì)陽性菌落進(jìn)行篩選。陽性菌落PCR結(jié)果表明目的基因已轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404當(dāng)中,成功獲得工程菌株。利用工程菌株對(duì)“油青四九”菜心帶柄子葉外植體進(jìn)行感染,通過對(duì)菌液濃度、感染時(shí)間、預(yù)培養(yǎng)和共培養(yǎng)時(shí)間等多個(gè)參數(shù)進(jìn)行試驗(yàn)優(yōu)化,最終得出較理想的試驗(yàn)條件。試驗(yàn)表明:將帶柄子葉預(yù)培養(yǎng)2～3d,用光密度值OD600為0.

4、5的菌液浸染8min左右,然后共培養(yǎng)2～3d。通過以上條件,帶柄子葉經(jīng)農(nóng)桿菌浸染后再生頻率可達(dá)到2.67％。
　　 pBJ40表達(dá)載體含有NPTⅡ基因,在對(duì)植株進(jìn)行篩選時(shí)可以選擇卡那霉素(Kan)為篩選用抗生素。試驗(yàn)對(duì)Kan取0.5、1、3、5、7mg/L五個(gè)濃度梯度。當(dāng)Kan濃度為0.5mg/L時(shí),多數(shù)外植體能產(chǎn)生不定芽,隨著Kan濃度的升高,再生綠芽率逐漸下降,當(dāng)Kan濃度達(dá)到5mg/L時(shí),所有再生芽全部白化。同時(shí)采用氨芐青

5、霉素(Amp)對(duì)農(nóng)桿菌進(jìn)行抑制試驗(yàn),在濃度低于300mg/L時(shí),農(nóng)桿菌仍能生長,外植體周邊可見菌落長出,在濃度高于300mg/L時(shí),培養(yǎng)基中無細(xì)菌生長,并且在100～500mg/L的濃度梯度范圍內(nèi),Amp對(duì)不定芽再生的影響并不明顯,最終將Amp濃度定在300mg/L。
　　 經(jīng)過組織培養(yǎng)、農(nóng)桿菌浸染等過程,最終得到4株再生植株。取再生植株葉片,用CTAB法提取基因組,經(jīng)PCR擴(kuò)增,結(jié)果表明4株轉(zhuǎn)化植株全部擴(kuò)增出目的條帶,與陽性對(duì)